α1—抗胰蛋白酶与维吾尔族慢性阻塞性肺疾病的相关性分析(2)
1资料与方法
1.1一般资料 选取2016年1月～2017年1月在本院呼吸一科住院的维吾尔族COPD患者作为病例组共227例，202例健康维吾尔族体检者作为对照组。病例组男性124例，女性103例，年龄39～92岁，平均年龄(66.01±8.54)岁，身高146～182 cm，平均身高(165.55±7.09)cm，体重40～130 kg，平均体重(70.85±10.69)kg，BMI 17.31～44.98 kg/m2，平均BMI(25.73±3.78)kg/m2 ，吸烟37例，生物燃料接触102例，对照组男性101例，女性101例，年龄40～92岁，平均年龄(66.76±9.39)岁，身高150～182 cm，平均身高(167.06±6.93) cm，体重39～131 kg，平均体重(69.92±13.87)kg，BMI 17.31～44.98 kg/m2， 平均BMI(25.73±3.78)kg/m2， 吸烟30例，生物燃料接触88例。两组一般资料对比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
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1.2纳入与排除标准 纳入标准：①符合2013年GOLD指南制定的COPD诊治指南的诊断标准；②有典型病史和临床表现并经体格检查及X线胸片或胸部CT等确诊；③肺功能指标： 吸入沙丁胺醇气雾剂400 μg后，FEV1 / FVC<70%， FEV1改善绝对值<200 ml并且百分数<12%；同期所有对照组受试者告知并签知情同意书，本研究项目通过医学伦理委员会审批。均取自同期喀什地区第一人民医院的健康体检者共147例，均满足以下条件：①X线胸片或胸部CT无慢性支气管炎、肺气肿等表现；②肺功能正常即FEV1/ pred%>80%；FEV1/FVC>70%。全部研究对象为喀什地区世居的维吾尔族人群，各研究对象之间没有任何血缘关系，排除标准：其他肺部疾病如：肺结核、支气管哮喘、支气管扩张症、肺间质性疾病以及肺癌。
1.3仪器与试剂 人血全基因组DNA试剂盒从德国 Greiner 公司购买；多重 PCR 及延伸引物由北京博奥生物有限公司使用Sequenom公司提供的MassARRAY Assay Design 软件合成；多重 PCR及延伸引物序列[5]。
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1.4方法
1.4.1 DNA提取 基因组DNA的提取所有研究对象抽取2 ml静脉血，给予EDTA抗凝，将标本放在-80 ℃冰箱保存，收集够血标本后将所有血标本送往北京博奥生物有限公司进行基因检测。
1.4.2基因检测
1.4.2.1引物设计 使用Sequenom公司Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点rs1243166的PCR擴增引物及单碱基延伸引物，并交由生物公司合成。具体为：上游5-ACGTTGGATGAAGCACATCACCCATTGACC-3，下游5-ACGTTGGATGAAGAAGTCAGGCTGCATGTG-3，延伸引物：5-CCCTCCCTTTCCTCC-3。
1.4.2.2基因分型分析所选位点的基因序列用多重 PCR 技术对进行扩增。反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃20 s， 56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环 45 次；72 ℃ 3 min；4 ℃保持。将 PCR 反应板放置于 PCR 仪上，启动 PCR 反应，将扩增产物保存在- 20 ℃备用。加入ddNTP并用SAP酶将上述扩增产物纯化，用单碱基延伸引物(约 20 bp)来完成SNP位点的扩增。延伸完毕后，进行 SNP 分型[2] 产物通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基因分型技术。
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1.4.3 α1-抗胰蛋白酶水平的测定 用EDTA管采集患者血液，在室温下静置 60 min 后进行离心，离心速度为3000 r/min，然后取上清液，严格按照试剂盒( 购于上海生物工程有限公司) 的操作说明进行血清α1-抗胰蛋白酶水平检测。
1.5统计学分析 采用 SPSS18.0 统计软件对数据进行分析，计量资料采用(x±s)表示，采用方差分析，若不符合采用秩和检验；计数资料采用(%)表示，行χ2 检验，P<0.05 为差异有统计学意义；基因频率采用基因计数法计算，检验基因型分布是否符合哈代平衡定律，COPD组和对照组α1-抗胰蛋白酶水平采用配对样本t检验，基因型等位基因频率采用？字2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2结果
2.1群体代表性检验 分别在病例组、对照组中进行哈代平衡检验，检验方法为基于模拟(simulation)的近似？字2检验，P取双侧。可以看出rs1243166位点基因型在病例组和对照组均符合Hardy-Weinberg平衡，见表1。
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2.2基因分型检测 PI(rs1243166)基因测序同时出现G、A、AG，证实该位点存在AA、GG、GA三种基因型，rs1243166位点基因型和等位基因频率在病例组和对照组中分布比较有统计学意义(P<0.05)，见表2。
2.3两组中rs1243166不同基因型患病风险分析 由于(rs1243166)GG、AG、AA三种基因型分布频率在患病组与对照组中比较差异有统计学意义(？字2=5.559，P<0.05)；基于共显性模型遗传模型，进行rs1243166基因型与疾病患病风险的关联分析，差异有统计学意义(P<0.05)，人群携带rs1243166-GG基因型患COPD的风险是携带rs1243166-AA基因型的2.039倍，携带rs1243166-GA基因型的人群患COPD的风险是携带rs1243166-AA基因型人群的1.875倍，见表3。
2.4 α1-抗胰蛋白酶水平的测定 病例组α1-抗胰蛋白酶水平为(1682.50±74.32)ng/ml，对照组α1-抗胰蛋白酶水平(985.45±80.25)ng/ml，病例组α1-抗胰蛋白酶水平高于对照组，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。, 百拇医药(钟雪梅 李黎 米热班·热夏提)
1.1一般资料 选取2016年1月～2017年1月在本院呼吸一科住院的维吾尔族COPD患者作为病例组共227例，202例健康维吾尔族体检者作为对照组。病例组男性124例，女性103例，年龄39～92岁，平均年龄(66.01±8.54)岁，身高146～182 cm，平均身高(165.55±7.09)cm，体重40～130 kg，平均体重(70.85±10.69)kg，BMI 17.31～44.98 kg/m2，平均BMI(25.73±3.78)kg/m2 ，吸烟37例，生物燃料接触102例，对照组男性101例，女性101例，年龄40～92岁，平均年龄(66.76±9.39)岁，身高150～182 cm，平均身高(167.06±6.93) cm，体重39～131 kg，平均体重(69.92±13.87)kg，BMI 17.31～44.98 kg/m2， 平均BMI(25.73±3.78)kg/m2， 吸烟30例，生物燃料接触88例。两组一般资料对比，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
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1.2纳入与排除标准 纳入标准：①符合2013年GOLD指南制定的COPD诊治指南的诊断标准；②有典型病史和临床表现并经体格检查及X线胸片或胸部CT等确诊；③肺功能指标： 吸入沙丁胺醇气雾剂400 μg后，FEV1 / FVC<70%， FEV1改善绝对值<200 ml并且百分数<12%；同期所有对照组受试者告知并签知情同意书，本研究项目通过医学伦理委员会审批。均取自同期喀什地区第一人民医院的健康体检者共147例，均满足以下条件：①X线胸片或胸部CT无慢性支气管炎、肺气肿等表现；②肺功能正常即FEV1/ pred%>80%；FEV1/FVC>70%。全部研究对象为喀什地区世居的维吾尔族人群，各研究对象之间没有任何血缘关系，排除标准：其他肺部疾病如：肺结核、支气管哮喘、支气管扩张症、肺间质性疾病以及肺癌。
1.3仪器与试剂 人血全基因组DNA试剂盒从德国 Greiner 公司购买；多重 PCR 及延伸引物由北京博奥生物有限公司使用Sequenom公司提供的MassARRAY Assay Design 软件合成；多重 PCR及延伸引物序列[5]。
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1.4方法
1.4.1 DNA提取 基因组DNA的提取所有研究对象抽取2 ml静脉血，给予EDTA抗凝，将标本放在-80 ℃冰箱保存，收集够血标本后将所有血标本送往北京博奥生物有限公司进行基因检测。
1.4.2基因检测
1.4.2.1引物设计 使用Sequenom公司Genotyping Tools 及MassARRAY Assay Design软件设计待测SNP位点rs1243166的PCR擴增引物及单碱基延伸引物，并交由生物公司合成。具体为：上游5-ACGTTGGATGAAGCACATCACCCATTGACC-3，下游5-ACGTTGGATGAAGAAGTCAGGCTGCATGTG-3，延伸引物：5-CCCTCCCTTTCCTCC-3。
1.4.2.2基因分型分析所选位点的基因序列用多重 PCR 技术对进行扩增。反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃20 s， 56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环 45 次；72 ℃ 3 min；4 ℃保持。将 PCR 反应板放置于 PCR 仪上，启动 PCR 反应，将扩增产物保存在- 20 ℃备用。加入ddNTP并用SAP酶将上述扩增产物纯化，用单碱基延伸引物(约 20 bp)来完成SNP位点的扩增。延伸完毕后，进行 SNP 分型[2] 产物通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱基因分型技术。
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1.4.3 α1-抗胰蛋白酶水平的测定 用EDTA管采集患者血液，在室温下静置 60 min 后进行离心，离心速度为3000 r/min，然后取上清液，严格按照试剂盒( 购于上海生物工程有限公司) 的操作说明进行血清α1-抗胰蛋白酶水平检测。
1.5统计学分析 采用 SPSS18.0 统计软件对数据进行分析，计量资料采用(x±s)表示，采用方差分析，若不符合采用秩和检验；计数资料采用(%)表示，行χ2 检验，P<0.05 为差异有统计学意义；基因频率采用基因计数法计算，检验基因型分布是否符合哈代平衡定律，COPD组和对照组α1-抗胰蛋白酶水平采用配对样本t检验，基因型等位基因频率采用？字2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。
2结果
2.1群体代表性检验 分别在病例组、对照组中进行哈代平衡检验，检验方法为基于模拟(simulation)的近似？字2检验，P取双侧。可以看出rs1243166位点基因型在病例组和对照组均符合Hardy-Weinberg平衡，见表1。
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2.2基因分型检测 PI(rs1243166)基因测序同时出现G、A、AG，证实该位点存在AA、GG、GA三种基因型，rs1243166位点基因型和等位基因频率在病例组和对照组中分布比较有统计学意义(P<0.05)，见表2。
2.3两组中rs1243166不同基因型患病风险分析 由于(rs1243166)GG、AG、AA三种基因型分布频率在患病组与对照组中比较差异有统计学意义(？字2=5.559，P<0.05)；基于共显性模型遗传模型，进行rs1243166基因型与疾病患病风险的关联分析，差异有统计学意义(P<0.05)，人群携带rs1243166-GG基因型患COPD的风险是携带rs1243166-AA基因型的2.039倍，携带rs1243166-GA基因型的人群患COPD的风险是携带rs1243166-AA基因型人群的1.875倍，见表3。
2.4 α1-抗胰蛋白酶水平的测定 病例组α1-抗胰蛋白酶水平为(1682.50±74.32)ng/ml，对照组α1-抗胰蛋白酶水平(985.45±80.25)ng/ml，病例组α1-抗胰蛋白酶水平高于对照组，两组间差异有统计学意义(P<0.05)。, 百拇医药(钟雪梅 李黎 米热班·热夏提)