Jmjd3和Ezh2酶活性抑制剂对人间充质干细胞成脂分化的影响及机制研究(1)
摘要：目的 研究EZH2和JMJD3对人脂肪间充质干细胞成脂分化的影响及可能机制。方法 体外培养人脂肪来源间充质干细胞并进行诱导分化。分化过程中分别加入EZH2酶活性抑制剂GSK126(6 μM)和JMJD3酶活性抑制剂GSKJ4(20 μM)，对照组加入DMSO。采用Realtime PCR方法检测脂肪细胞分化基因PPARγ、FABP4和ADIPOQ;棕色化标志基因UCP1、PRDM16和CIDEA，以及米色脂肪独有的标志基因CD137、TMEM26和TBX1，并计算各组与对照组的相对表达量。采用Western Blot法检测H3K27me3、UCP1、JAK2、STAT3和pSTST3的蛋白表达量。结果 GSK126组的脂滴形成略减少，GSKJ4组的脂滴形成明显减少。GSK126组的H3K27me3含量减少，GSKJ4组的H3K27me3含量增加;GSK126组的UCP1、PRDM16、TMEM26和JAK2基因表达均明显增加(P<0.05);GSKJ4组的PPARγ、UCP1和JAK2的基因表达量均明显降低(P<0.05);GSK126组的UCP1蛋白表达增加而GSKJ4组UCP1蛋白表达减少。GSK126组的JAK2和pSTST3均增加，GSKJ4组的JAK2和pSTST3蛋白表达均减少。结论 EZH2酶活性抑制剂GSK126促进人MSC向棕色或米色脂肪细胞分化。JMJD3酶活性抑制剂GSKJ4抑制人MSC向棕色或米色脂肪细胞分化;EZH2和JMJD3的酶活性影响H3K27的三甲基化修饰，可能通过JAK2-STAT信号通路，发挥调控人脂肪细胞分化的作用。
, 百拇医药
关键词：间充质干细胞;分化;EZH2;JMJD3;UCP1;JAK2c
中图分类号：R364.2 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.020
文章编号：1006-1959(2019)02-0063-06
肥胖是当今世界最常见的慢性非传染性疾病之一[1]，我国的肥胖人数已达世界之最，2010年的调查结果显示，有41.7%以上的人群处于超重或者肥胖状态[2]。肥胖可以引发多种疾病，如胰岛素抵抗、2型糖尿病、心脑血管疾病、骨关节炎、部分癌症等[3，4]。多项研究表明，啮齿动物和人体内的棕色和米色脂肪细胞可以通过产热消耗能量，对抗肥胖和胰岛素抵抗，因而这两类脂肪细胞的分化成为肥胖治疗领域的研究热点[5]。
, 百拇医药
目前对于脂肪细胞分化的研究已由针对单个基因功能的研究转为基因表达调控的研究，如表观遗传学调控机制。组蛋白修饰是表观遗传调控基因表达的方式之一，研究发现，组蛋白H3K27me3去甲基化酶jmjd3可以促进小鼠棕色脂肪细胞的分化[6]，而H3K27me3甲基转移酶Ezh2可以在体外促进小鼠白色和棕色脂肪细胞的分化[7]，但在人体细胞尚无相关报道，其调控机制亦尚不清楚。研究发现，JAK2可通过JAK2/STAT途径调控脂肪细胞分化[8]。本实验拟以人脂肪来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)为研究对象，在诱导分化过程中使用EZH2酶活性抑制剂GSK126或JMJD3酶活性抑制剂GSKJ4处理细胞，观察细胞成脂分化情况，并检测JAK2及STAT3的表达，揭示Jmjd3和Ezh2对人间充质干细胞向脂肪细胞分化过程的影响及可能机制。
1材料与方法
1.1主要试剂 人脂肪来源间充质干细胞(中科院上海细胞库);间充质干细胞培养液(MSCM，7501，美国Sciencell);DMEM培養液(美国Sigma);胎牛血清(四季青);人用生物合成短效胰岛素(诺和灵R，诺和诺德);3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)(美国Sigma);地塞米松(美国Sigma);三碘甲腺原氨酸(T3，上海麦克林);罗格列酮(麦克林)。用于western blot的一抗：兔Ezh2 抗体(1∶1000;CST);兔Jmjd3抗体(1∶1000，Abcam);兔H3K27me3抗体(1∶1000;Abcam);兔JAK2抗体(1∶1000;Abcam);兔STAT3抗体(1∶1000;Abcam);兔磷酸化STAT3抗体(1∶1000;Abcam);小鼠β-Tubulin(1∶1000;天津三箭)。二抗：HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗鼠IgG(1∶5000;北京中杉金桥)。全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)。用于Realtime PCR的RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、Syber Green Master Mix(日本Takara)。小分子抑制剂GSK126、GSKJ4(美国MCE);油红0粉末(Sigma)。
1.2细胞的分化方法 实验设3个组，分别为对照组，GSK126组和GSKJ4组，将细胞种于12孔板内，每个组设3个复孔。细胞扩增达100%汇合时出现接触抑制，细胞停止分裂进入分化阶段(G0期)，设为分化第2天。接触抑制2 d后，开始分化，为分化第0天。每孔加入分化液，并且按照设计分别加入GSK126、GSKJ4或DMSO;分化液培养2 d后换用维持培养液培养，每隔2 d换液1次，换液后根据分组加入GSK126或GSKJ4，对照组加入等体积DMSO。分化第8天时，对照组已经全部出现脂滴，此时结束分化。, 百拇医药(武晓慧 李蓉 黄振鹏 杨帆 陈佳琪)
, 百拇医药
关键词：间充质干细胞;分化;EZH2;JMJD3;UCP1;JAK2c
中图分类号：R364.2 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.020
文章编号：1006-1959(2019)02-0063-06
肥胖是当今世界最常见的慢性非传染性疾病之一[1]，我国的肥胖人数已达世界之最，2010年的调查结果显示，有41.7%以上的人群处于超重或者肥胖状态[2]。肥胖可以引发多种疾病，如胰岛素抵抗、2型糖尿病、心脑血管疾病、骨关节炎、部分癌症等[3，4]。多项研究表明，啮齿动物和人体内的棕色和米色脂肪细胞可以通过产热消耗能量，对抗肥胖和胰岛素抵抗，因而这两类脂肪细胞的分化成为肥胖治疗领域的研究热点[5]。
, 百拇医药
目前对于脂肪细胞分化的研究已由针对单个基因功能的研究转为基因表达调控的研究，如表观遗传学调控机制。组蛋白修饰是表观遗传调控基因表达的方式之一，研究发现，组蛋白H3K27me3去甲基化酶jmjd3可以促进小鼠棕色脂肪细胞的分化[6]，而H3K27me3甲基转移酶Ezh2可以在体外促进小鼠白色和棕色脂肪细胞的分化[7]，但在人体细胞尚无相关报道，其调控机制亦尚不清楚。研究发现，JAK2可通过JAK2/STAT途径调控脂肪细胞分化[8]。本实验拟以人脂肪来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)为研究对象，在诱导分化过程中使用EZH2酶活性抑制剂GSK126或JMJD3酶活性抑制剂GSKJ4处理细胞，观察细胞成脂分化情况，并检测JAK2及STAT3的表达，揭示Jmjd3和Ezh2对人间充质干细胞向脂肪细胞分化过程的影响及可能机制。
1材料与方法
1.1主要试剂 人脂肪来源间充质干细胞(中科院上海细胞库);间充质干细胞培养液(MSCM，7501，美国Sciencell);DMEM培養液(美国Sigma);胎牛血清(四季青);人用生物合成短效胰岛素(诺和灵R，诺和诺德);3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)(美国Sigma);地塞米松(美国Sigma);三碘甲腺原氨酸(T3，上海麦克林);罗格列酮(麦克林)。用于western blot的一抗：兔Ezh2 抗体(1∶1000;CST);兔Jmjd3抗体(1∶1000，Abcam);兔H3K27me3抗体(1∶1000;Abcam);兔JAK2抗体(1∶1000;Abcam);兔STAT3抗体(1∶1000;Abcam);兔磷酸化STAT3抗体(1∶1000;Abcam);小鼠β-Tubulin(1∶1000;天津三箭)。二抗：HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗鼠IgG(1∶5000;北京中杉金桥)。全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)。用于Realtime PCR的RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、Syber Green Master Mix(日本Takara)。小分子抑制剂GSK126、GSKJ4(美国MCE);油红0粉末(Sigma)。
1.2细胞的分化方法 实验设3个组，分别为对照组，GSK126组和GSKJ4组，将细胞种于12孔板内，每个组设3个复孔。细胞扩增达100%汇合时出现接触抑制，细胞停止分裂进入分化阶段(G0期)，设为分化第2天。接触抑制2 d后，开始分化，为分化第0天。每孔加入分化液，并且按照设计分别加入GSK126、GSKJ4或DMSO;分化液培养2 d后换用维持培养液培养，每隔2 d换液1次，换液后根据分组加入GSK126或GSKJ4，对照组加入等体积DMSO。分化第8天时，对照组已经全部出现脂滴，此时结束分化。, 百拇医药(武晓慧 李蓉 黄振鹏 杨帆 陈佳琪)