江苏宿迁地区Hp感染及粪便基因检测克拉霉素耐药现状(1)
摘要：目的 了解江苏宿迁地区幽门螺杆菌(Hp)感染及对克拉霉素的耐药情况。方法 收集2016年10月～2017年10月在宿迁市第一人民医院行14C呼气试验检查的健康体检者的Hp检查结果，随机留取412例受检者的个人资料，并随机留取146例Hp感染者的粪便标本行粪便基因克拉霉素药敏试验，统计Hp感染率，比较相关因素对Hp感染的影响，初步了解Hp克拉霉素耐药情况。结果 共2919例纳入研究，1248例Hp阳性(42.75%)，男性人群的Hp感染率为44.89%，高于女性的39.89%(P<0.05)，20岁以下人群Hp阳性率最低(35.42%)，21～40岁人群感染率最高(45.18%)，40岁以上人群随年龄增大感染率有下降趋势，Hp感染与抽烟、饮酒、个人收入及空腹血糖值之间均无明显关系，146例Hp阳性的粪便标本中，137例可成功提取细菌基因组DNA，其中29个样本的PCR产物经BsaⅠ酶切出现两条目的条带，所有样本的PCR产物经MboⅡ酶切后均未被切开。结论 江苏宿迁地区Hp感染率为42.75%，男性人群及年龄在20～40岁感染率高，粪便基因药敏试验显示克拉霉素耐药率高于21.17%，这将为宿迁地区Hp感染防治提供更有力的依据。
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关键词：幽门螺杆菌感染;宿迁地区;粪便基因检测;克拉霉素耐药
中图分类号：R378 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.026
文章编号：1006-1959(2019)02-0091-04
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。流行病学研究表明，Hp是世界上感染率最高的细菌之一，尤其在发展中国家，严重威胁着人类健康[1]。在我国不同地区，Hp感染率不同，且各年龄阶段Hp感染率也不相同，详细了解各个地区Hp感染状况及易感因素，有助于该地区Hp感染及相关疾病的防治[2]。宿迁地区位于江苏北部，经济相对落后，有关该地区的Hp感染状况，尚无相关研究报道。Hp根除治疗方法较多，在中国大陆地区，含质子泵抑制剂(PPI)、克拉霉素、阿莫西林(或甲硝唑)的标准三联疗法常作为根除一线疗法，但随着Hp对克拉霉素及甲硝唑耐药率的逐年增加，标准三联的根除率在不断减低[3]。马斯特里赫特Ⅳ共识意见提出，当地区克拉霉素耐药率达到15%时，未经敏感性检测的含有PPI+克拉霉素的三联根除治疗方案应当被摒弃[4]。因此，了解一个地区的克拉霉素耐药情况对于指导Hp的根除治疗具有极其重要的意义。本研究中，我们统计了近1年来宿迁地区体检行14C呼气试验人群的Hp感染率和各种相关危险因素对Hp感染率的影响，并留取部分Hp感染者粪便标本行粪便基因克拉霉素耐药分析，进一步了解宿迁地区Hp感染及克拉霉素耐药情况，从而为临床医师根除Hp治疗提供有力的依据。
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1资料与方法
1.1一般资料 纳入人群为2016年10月～2017年10月在宿迁市第一人民医院行14C呼气试验的健康体检者，所纳入者均为宿迁籍长期居住人员，受检前至少4周未服用抗生素、抑酸药或铋剂，排除有胃部手术史、孕妇及哺乳期妇女，共计2919例纳入研究，随机留取412例受检者个人资料，包括性别、年龄、抽烟饮酒情况、收入状况及空腹血糖值，并随机留取146例Hp感染者的粪便标本行粪便基因克拉霉素药敏试验。
1.2方法
1.2.1 14C呼气试验检测方法 使用安徽养和医疗器械设备公司生产的YH04E幽门螺旋杆菌检测仪和呼气卡，受检者至少空腹3 h以上，用温开水吞服14C-尿素胶囊后，静坐15 min后向呼气卡中吹气留取样本，卡上指示窗内颜色有蓝色变为白色时完成取样，将卡插入检测仪的进样口，14C-UBT≥100 dpm/mmol CO2时判定为Hp感染。
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1.2.2粪便药敏试验方法 ①粪便细菌基因组DNA提取：称取180～220 mg冻存粪便标本，使用粪便DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，按照操作步骤，提取粪便细菌基因组DNA，并通过Nano-Drop300(杭州奥盛仪器有限公司)检测DNA浓度及纯度，通过测定OD260/OD280比值估计DNA的纯度，OD260/OD280>1.8，说明DNA纯度较高，通过琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性，凝胶电泳条带清晰说明无污染。②Hp 23s rRNA基因扩增：第一轮扩增引物为Hp 23s rRNA1835F：5'-GGTCTCAGCAAAGAGTCCCT-3'，2327R：5'-CCCACCAAGCATTGTCCT-3'，长度为493bp，第二轮扩增引物为Hp 23s rRNA 1942F：5'-AGGATGCGTCAGTCGCAAGAT-3'，2308R：5'-CCTGTGGATAACACAGGCCAGT-3'，长度为381bp。PCR反应体系包括：2x mix 15μl+MgCl2 1.2μl+上游引物(F)0.8μl+下游引物(R)0.8μl+模板1μl+灭菌H2O 11.2μl，反应体系中作为模板的基因组DNA浓度在5 μl/ml左右，引物浓度在10 nM。一轮扩增反应条件：95℃预变性2 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，5个循环，4℃变性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸20 s，30个循环，4℃ 5 min。二轮扩增反应条件：95℃预变性2 min，94℃变性20 s，63℃退火20 s，72℃延伸20 s，28个循环，72℃延伸7 min，4℃ 5 min。反应结束后将PCR扩增产物取出，置于4℃冰箱保存备用。琼脂糖凝胶电泳成像检测PCR产物。③PCR产物酶切：使用限制性内切酶对PCR扩增产物进行特异性位点的酶切，BsaⅠ酶(2143)识别位点序列：5-GGTCTC(N)1，3-CCAGAG(N)5，酶切产物长度为208bp和173bp。MboⅡ酶(2142)识别位点序列：5-GAAGA(N)8，3-CTTCT9(N)5，酶切产物长度为191bp和190bp。酶切体系成分包括：10xBuffer 1.5μl+BsaⅠ/MboⅡ 0.5μl+PCR产物5μl+ddH2O 8μl，反应体系轻轻混匀置于37℃恒温水浴锅，孵育过夜，反应产物經2%琼脂糖凝胶电泳观察。④粪便基因组DNA测序验证：所有PCR扩增成功的样本中随机选取66个样本送上海生工测序，测序结果与酶切结果相互比较。, 百拇医药(刘伟 王艳 朱季军 刘云云 王玉欣 王晓燕)
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关键词：幽门螺杆菌感染;宿迁地区;粪便基因检测;克拉霉素耐药
中图分类号：R378 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.02.026
文章编号：1006-1959(2019)02-0091-04
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。流行病学研究表明，Hp是世界上感染率最高的细菌之一，尤其在发展中国家，严重威胁着人类健康[1]。在我国不同地区，Hp感染率不同，且各年龄阶段Hp感染率也不相同，详细了解各个地区Hp感染状况及易感因素，有助于该地区Hp感染及相关疾病的防治[2]。宿迁地区位于江苏北部，经济相对落后，有关该地区的Hp感染状况，尚无相关研究报道。Hp根除治疗方法较多，在中国大陆地区，含质子泵抑制剂(PPI)、克拉霉素、阿莫西林(或甲硝唑)的标准三联疗法常作为根除一线疗法，但随着Hp对克拉霉素及甲硝唑耐药率的逐年增加，标准三联的根除率在不断减低[3]。马斯特里赫特Ⅳ共识意见提出，当地区克拉霉素耐药率达到15%时，未经敏感性检测的含有PPI+克拉霉素的三联根除治疗方案应当被摒弃[4]。因此，了解一个地区的克拉霉素耐药情况对于指导Hp的根除治疗具有极其重要的意义。本研究中，我们统计了近1年来宿迁地区体检行14C呼气试验人群的Hp感染率和各种相关危险因素对Hp感染率的影响，并留取部分Hp感染者粪便标本行粪便基因克拉霉素耐药分析，进一步了解宿迁地区Hp感染及克拉霉素耐药情况，从而为临床医师根除Hp治疗提供有力的依据。
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1资料与方法
1.1一般资料 纳入人群为2016年10月～2017年10月在宿迁市第一人民医院行14C呼气试验的健康体检者，所纳入者均为宿迁籍长期居住人员，受检前至少4周未服用抗生素、抑酸药或铋剂，排除有胃部手术史、孕妇及哺乳期妇女，共计2919例纳入研究，随机留取412例受检者个人资料，包括性别、年龄、抽烟饮酒情况、收入状况及空腹血糖值，并随机留取146例Hp感染者的粪便标本行粪便基因克拉霉素药敏试验。
1.2方法
1.2.1 14C呼气试验检测方法 使用安徽养和医疗器械设备公司生产的YH04E幽门螺旋杆菌检测仪和呼气卡，受检者至少空腹3 h以上，用温开水吞服14C-尿素胶囊后，静坐15 min后向呼气卡中吹气留取样本，卡上指示窗内颜色有蓝色变为白色时完成取样，将卡插入检测仪的进样口，14C-UBT≥100 dpm/mmol CO2时判定为Hp感染。
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1.2.2粪便药敏试验方法 ①粪便细菌基因组DNA提取：称取180～220 mg冻存粪便标本，使用粪便DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)，按照操作步骤，提取粪便细菌基因组DNA，并通过Nano-Drop300(杭州奥盛仪器有限公司)检测DNA浓度及纯度，通过测定OD260/OD280比值估计DNA的纯度，OD260/OD280>1.8，说明DNA纯度较高，通过琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA的完整性，凝胶电泳条带清晰说明无污染。②Hp 23s rRNA基因扩增：第一轮扩增引物为Hp 23s rRNA1835F：5'-GGTCTCAGCAAAGAGTCCCT-3'，2327R：5'-CCCACCAAGCATTGTCCT-3'，长度为493bp，第二轮扩增引物为Hp 23s rRNA 1942F：5'-AGGATGCGTCAGTCGCAAGAT-3'，2308R：5'-CCTGTGGATAACACAGGCCAGT-3'，长度为381bp。PCR反应体系包括：2x mix 15μl+MgCl2 1.2μl+上游引物(F)0.8μl+下游引物(R)0.8μl+模板1μl+灭菌H2O 11.2μl，反应体系中作为模板的基因组DNA浓度在5 μl/ml左右，引物浓度在10 nM。一轮扩增反应条件：95℃预变性2 min，94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，5个循环，4℃变性15 s，57℃退火15 s，72℃延伸20 s，30个循环，4℃ 5 min。二轮扩增反应条件：95℃预变性2 min，94℃变性20 s，63℃退火20 s，72℃延伸20 s，28个循环，72℃延伸7 min，4℃ 5 min。反应结束后将PCR扩增产物取出，置于4℃冰箱保存备用。琼脂糖凝胶电泳成像检测PCR产物。③PCR产物酶切：使用限制性内切酶对PCR扩增产物进行特异性位点的酶切，BsaⅠ酶(2143)识别位点序列：5-GGTCTC(N)1，3-CCAGAG(N)5，酶切产物长度为208bp和173bp。MboⅡ酶(2142)识别位点序列：5-GAAGA(N)8，3-CTTCT9(N)5，酶切产物长度为191bp和190bp。酶切体系成分包括：10xBuffer 1.5μl+BsaⅠ/MboⅡ 0.5μl+PCR产物5μl+ddH2O 8μl，反应体系轻轻混匀置于37℃恒温水浴锅，孵育过夜，反应产物經2%琼脂糖凝胶电泳观察。④粪便基因组DNA测序验证：所有PCR扩增成功的样本中随机选取66个样本送上海生工测序，测序结果与酶切结果相互比较。, 百拇医药(刘伟 王艳 朱季军 刘云云 王玉欣 王晓燕)