去睾丸老年大鼠血管钙化程度与骨代谢水平研究(2)
老年性骨质疏松和血管钙化均为衰老伴行的高发疾病，在老龄化社会尤为需要引起重视。临床观察发现二者存在一定的相关性，近年来大量的基础及临床研究也证实了这一点[1，2]。这无疑为同步防治骨质疏松和血管钙化带来了佳音。为了更好地研究二者相关性需要建立更符合发病机制、病理变化的动物模型。在目前的研究当中，多以建立血管钙化模型或SAMP6快速老化骨质疏松模型来研究两者相关性。本研究则通过双侧睾丸切除术建立老年性骨质疏松大鼠模型，观察老年性骨质疏松大鼠血管钙化情况及骨代谢变化，旨在为老年性骨质疏松和血管钙化相关性的基础研究提供参考依据。
1材料与方法
1.1仪器与试剂 DEXA(Hologic公司);茜素红S(Sigma公司);大鼠血清P1NP、BGP和CTX-Ⅰ的ELISA检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.2实验动物与分组 选取7月龄SPF级雄性SD大鼠16只，体重500～650 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。适应性饲养1周后，随机分为造模组及对照组，每组8只。
, 百拇医药
1.3实验方法
1.3.1骨质疏松模型建立 术前12 h禁食禁水，使用2%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，深度麻醉后固定、脱毛、消毒，严格遵守无菌原则。在阴囊部位作1 cm切口切開阴囊皮肤，分离睾丸及附睾，结扎后切除睾丸，止血，逐层缝合。术后给予抗感染治疗。造模组行双侧睾丸切除术，对照组仅切除睾丸周围部分脂肪组织。
1.3.2 BMD检测 术后6个月将所有大鼠用2%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后腹主动脉采血处死，取右侧完整股骨标本，将所附着的肌肉和软组织剔除干净。采用DEXA测定股骨BMD。
1.3.3茜素红S染色观察钙化情况 选取胸主动脉标本节段，用生理盐水反复冲洗，福尔马林固定24 h，常规石蜡包埋切片，经二甲苯脱蜡和各级乙醇水洗，2%茜素红染色5 min，封片，镜下观察钙化情况。
1.3.4血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ的ELISA检测 腹主动脉取血，3000 r/min离心10 min，分离血清后-20℃保存待测。所有指标的检测均根据ELISA试剂盒说明书要求进行，用酶标仪(波长450 nm)测定样本吸光度，根据标准曲线计算含量。
, 百拇医药
1.4统计学方法 实验数据用SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，符合正态分布、方差齐的数据比较采用t检验，若数据为非正态分布或方差不齐，则采用非参数秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异统计学意义显著。
2结果
2.1两组大鼠股骨BMD比较 造模组大鼠股骨BMD为(0.2636±0.0096)g/cm2，低于对照组的(0.3104±0.0157)g/cm2，差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2两组大鼠胸主动脉钙化情况 茜素红S染色结果显示：对照组胸主动脉各层结构完整，均未见明显的钙化，造模组胸主动脉可见大量散在桔红色钙化沉积。与对照相比，造模组胸主动脉钙化明显增加。见图1。
2.3两组大鼠血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ水平比较 造模组血清中P1NP和BGP水平低于对照组，CTX-Ⅰ水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
, 百拇医药
3讨论
流行病学调查表明，全球50岁以上的人口中约有1/3的女性和1/5的男性被不同程度的骨质疏松所困扰[3]，其较高的致残率给患者和社会带来一定的健康和经济负担。骨质疏松包括原发性骨质疏松和继发性骨质疏松，其中原发性骨质疏松又分为老年性骨质疏松和绝经后骨质疏松。目前大部分研究针对绝经后骨质疏松，而本研究选取7月龄雄性大鼠，通过双侧睾丸切除术建立老年性骨质疏松大鼠模型并饲养了6个月。模拟了随年龄增长，性激素水平逐渐下降、机体功能衰退，导致以骨形成减少为主的骨代谢失衡过程。不同于采用去卵巢建立雌激素下降引起骨吸收增加的绝经后骨质疏松。本研究结果显示，造模组BMD较对照组明显下降，提示高龄大鼠切除睾丸后，可成功复制出骨质疏松模型。
老年性骨质疏松是与衰老伴行的骨丢失，由于机体功能衰退，骨髓基质细胞向成骨细胞转化受阻，成骨细胞减少而破骨细胞功能正常[4]。BMD是国际公认用来诊断骨质疏松并观察疗效的金标准，但存在局限性。而骨代谢标志物能不依赖于BMD，优先初步反映治疗效果及骨折风险。包括骨形成标志物PⅠNP和BGP，和骨吸收标志物CTX-Ⅰ等。骨形成标志物PⅠNP和BGP随年龄增长而降低，是临床常用反映骨形成的生化指标，具有较高的敏感性和特异性[5]。本研究中，大鼠血清PⅠNP和BGP水平均降低，而骨吸收标志物CTX-Ⅰ水平升高。证明了老年人由于骨细胞转换率下降，成骨细胞分泌减少、活性降低，骨形成减少，导致血清中骨形成标志物降低，而破骨细胞功能正常。这与国内外实验研究相符合，也与临床上老年性骨质疏松所表现的骨形成标志物降低相一致[6]。
, http://www.100md.com
大量临床研究表明，老年性骨质疏松和血管钙化的发生率呈正相关[7，8]，二者在危险因素、发病机制和临床治疗等方面也存在一定的联系[9，10]。越来越多研究显示，血管钙化是血管平滑肌细胞表型向成骨样细胞表型转化且可预防可逆转的主动调节过程，并伴随有矿化合成调节蛋白(如骨钙蛋白、骨桥蛋白等)的增多，与成骨的矿化过程相似[11]。同时，骨组织中流失的钙盐沉积于血管壁上则形成钙化，在钙化的血管中也发现了许多骨相关细胞蛋白因子(如骨保护素、骨钙素、γ-羧基谷氨酸基质蛋白等)[12-14]。
若在此过程中，发现某种关联的共同致病因子并从中阻断，可提前识别个体发生疾病的风险并预防诊治，对进一步揭示二者的共同发病机制对危害老年健康的两大公共问题的处置具有重大意义。本实验初步提示了，摘除睾丸的高龄大鼠在形成骨质疏松的同时也产生了血管钙化，为研究老年性骨质疏松和血管钙化相关性提供一定的模型研究基础。但二者之间关系复杂多样，其确切机制还有待进一步深入研究。, 百拇医药(杨娜 周进平 林晓容)
1材料与方法
1.1仪器与试剂 DEXA(Hologic公司);茜素红S(Sigma公司);大鼠血清P1NP、BGP和CTX-Ⅰ的ELISA检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.2实验动物与分组 选取7月龄SPF级雄性SD大鼠16只，体重500～650 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。适应性饲养1周后，随机分为造模组及对照组，每组8只。
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1.3实验方法
1.3.1骨质疏松模型建立 术前12 h禁食禁水，使用2%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，深度麻醉后固定、脱毛、消毒，严格遵守无菌原则。在阴囊部位作1 cm切口切開阴囊皮肤，分离睾丸及附睾，结扎后切除睾丸，止血，逐层缝合。术后给予抗感染治疗。造模组行双侧睾丸切除术，对照组仅切除睾丸周围部分脂肪组织。
1.3.2 BMD检测 术后6个月将所有大鼠用2%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉后腹主动脉采血处死，取右侧完整股骨标本，将所附着的肌肉和软组织剔除干净。采用DEXA测定股骨BMD。
1.3.3茜素红S染色观察钙化情况 选取胸主动脉标本节段，用生理盐水反复冲洗，福尔马林固定24 h，常规石蜡包埋切片，经二甲苯脱蜡和各级乙醇水洗，2%茜素红染色5 min，封片，镜下观察钙化情况。
1.3.4血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ的ELISA检测 腹主动脉取血，3000 r/min离心10 min，分离血清后-20℃保存待测。所有指标的检测均根据ELISA试剂盒说明书要求进行，用酶标仪(波长450 nm)测定样本吸光度，根据标准曲线计算含量。
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1.4统计学方法 实验数据用SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料以(x±s)表示，符合正态分布、方差齐的数据比较采用t检验，若数据为非正态分布或方差不齐，则采用非参数秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异统计学意义显著。
2结果
2.1两组大鼠股骨BMD比较 造模组大鼠股骨BMD为(0.2636±0.0096)g/cm2，低于对照组的(0.3104±0.0157)g/cm2，差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2两组大鼠胸主动脉钙化情况 茜素红S染色结果显示：对照组胸主动脉各层结构完整，均未见明显的钙化，造模组胸主动脉可见大量散在桔红色钙化沉积。与对照相比，造模组胸主动脉钙化明显增加。见图1。
2.3两组大鼠血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ水平比较 造模组血清中P1NP和BGP水平低于对照组，CTX-Ⅰ水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
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3讨论
流行病学调查表明，全球50岁以上的人口中约有1/3的女性和1/5的男性被不同程度的骨质疏松所困扰[3]，其较高的致残率给患者和社会带来一定的健康和经济负担。骨质疏松包括原发性骨质疏松和继发性骨质疏松，其中原发性骨质疏松又分为老年性骨质疏松和绝经后骨质疏松。目前大部分研究针对绝经后骨质疏松，而本研究选取7月龄雄性大鼠，通过双侧睾丸切除术建立老年性骨质疏松大鼠模型并饲养了6个月。模拟了随年龄增长，性激素水平逐渐下降、机体功能衰退，导致以骨形成减少为主的骨代谢失衡过程。不同于采用去卵巢建立雌激素下降引起骨吸收增加的绝经后骨质疏松。本研究结果显示，造模组BMD较对照组明显下降，提示高龄大鼠切除睾丸后，可成功复制出骨质疏松模型。
老年性骨质疏松是与衰老伴行的骨丢失，由于机体功能衰退，骨髓基质细胞向成骨细胞转化受阻，成骨细胞减少而破骨细胞功能正常[4]。BMD是国际公认用来诊断骨质疏松并观察疗效的金标准，但存在局限性。而骨代谢标志物能不依赖于BMD，优先初步反映治疗效果及骨折风险。包括骨形成标志物PⅠNP和BGP，和骨吸收标志物CTX-Ⅰ等。骨形成标志物PⅠNP和BGP随年龄增长而降低，是临床常用反映骨形成的生化指标，具有较高的敏感性和特异性[5]。本研究中，大鼠血清PⅠNP和BGP水平均降低，而骨吸收标志物CTX-Ⅰ水平升高。证明了老年人由于骨细胞转换率下降，成骨细胞分泌减少、活性降低，骨形成减少，导致血清中骨形成标志物降低，而破骨细胞功能正常。这与国内外实验研究相符合，也与临床上老年性骨质疏松所表现的骨形成标志物降低相一致[6]。
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大量临床研究表明，老年性骨质疏松和血管钙化的发生率呈正相关[7，8]，二者在危险因素、发病机制和临床治疗等方面也存在一定的联系[9，10]。越来越多研究显示，血管钙化是血管平滑肌细胞表型向成骨样细胞表型转化且可预防可逆转的主动调节过程，并伴随有矿化合成调节蛋白(如骨钙蛋白、骨桥蛋白等)的增多，与成骨的矿化过程相似[11]。同时，骨组织中流失的钙盐沉积于血管壁上则形成钙化，在钙化的血管中也发现了许多骨相关细胞蛋白因子(如骨保护素、骨钙素、γ-羧基谷氨酸基质蛋白等)[12-14]。
若在此过程中，发现某种关联的共同致病因子并从中阻断，可提前识别个体发生疾病的风险并预防诊治，对进一步揭示二者的共同发病机制对危害老年健康的两大公共问题的处置具有重大意义。本实验初步提示了，摘除睾丸的高龄大鼠在形成骨质疏松的同时也产生了血管钙化，为研究老年性骨质疏松和血管钙化相关性提供一定的模型研究基础。但二者之间关系复杂多样，其确切机制还有待进一步深入研究。, 百拇医药(杨娜 周进平 林晓容)