骨碎补对牙周炎大鼠正畸牙移动保持阶段RANKL表达影响的研究(2)
Key words：Orthodontic;Periodontitis;Tooth movement;RANKL
口腔正畸治疗牙周病可以减轻患牙松动度、改善病患的出血情况，降低病患牙周袋深度[1]。但是正畸牙移动后，牙周膜纤维组织改建较慢并有恢复趋势，很容易使牙齿发生移动。目前对牙周病正畸治疗后保持阶段研究较少。中药骨碎补具有强骨、止痛的功效。现已被制成多种制剂用于牙齿松动、跌扑闪挫、筋骨折伤[2]。转录因子NF-KB受体活化剂配体(receptor activator of NF-kB ligand，RANKL)是参与骨改建的重要细胞因子之一。成骨細胞和基质细胞均表达RANKL和OPG，都能与破骨细胞表面的RANK结合，RANKL与破骨细胞细胞膜上的RANK结合，促进破骨细胞的分化成熟，并且抑制破骨细胞的凋亡[3]。本研究通过给患有牙周炎正畸牙移动保持阶段的大鼠灌服水煎骨碎补中药，用免疫组化检测RANKL因子的表达，探讨中药骨碎补在牙周炎正畸牙移动后保持阶段对牙周膜及牙槽骨的改建作用，为缩短牙周炎正畸患者保持时间提供实验依据。
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1材料与方法
1.1材料 每2000 ml 水中加 20 g 骨碎补(购于黑龙江省佳木斯中医院)浸泡 30 min，加热至沸腾半个小时后滤渣，将滤液浓缩至 200 ml，即制成 100% 浓度的水煎剂。
1.2实验动物 选择清洁级Wistar大鼠，雄性，体重(180～220 g)45只[购于佳木斯大学动物实验中心，许可证号SCXK(黑)2013-001]，按照《实验动物保护条例》饲养，消毒，清理，喂养无菌饲料(由佳木斯动物实验中心提供)，饲养1周后开始动物实验。
1.3方法
1.3.1分组 按照随机数字表法将大鼠分成9个组，每组5只，进行标记。其中1组设为空白组，4组对照组，4组实验组。牙周炎组建立牙周炎模型，注射过量10%的水合氯醛处死，HE染色及免疫组化染色。实验组和对照组建立牙周炎及正畸牙移动模型，实验组灌服骨碎补水煎液，对照组灌服等量的0.9%氯化钠溶液。分别在第3，7，14，21 d处死，HE染色及免疫组化染色。
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1.3.2实验动物模型建立 牙周炎动物模型建立：用10%水合氯醛3.5 ml/kg(100 ml，雷根生物供应室，实验使用)，腹腔麻醉，仰卧位固定，上开口器(用0.9 mm不锈钢弯制)，用探针(口腔器械盒，保定市医疗器械有限公司)将大鼠上颌左侧第一磨牙牙龈剥离。在大鼠上颌左侧第一磨牙近中牙颈部龈沟处用快速手机(402高速手机，顺逊医疗器械)磨0.2 mm深固位沟，选用0.20 mm结扎丝(杭州奥索医疗器械有限公司)将大鼠上颌左侧第一磨牙结扎(尽量结扎到牙龈沟处)。给大鼠喂养高糖水(100 g/L)，将饲料(佳木斯大学动物实验中心提供)泡软，为期1个月。1个月观察可见上颌第一磨牙牙龈红肿、探诊出血、牙周袋，即牙周炎动物模型建立成功。
正畸牙移动模型建立：将大鼠麻醉，固定，大鼠上颌两颗中切牙颈部的远中面磨出深0.2 mm的固位沟，拉簧(镍钛合金牙齿矫形拉簧，北京圣玛科技有限公司)一侧连接大鼠磨牙，另一侧与大鼠切牙连接。测力计(杭州奥索牙用测力计杆式测力计，50/格)测拉力约50 g，加力21 d。建立保持期模型，用结扎丝连扎大鼠第一磨牙及切牙，保持第一磨牙移动后位置。在加力装置去除前1 d开始灌服。实验组灌服骨碎补水煎液(中医院购买，制备成0.9 g/kg溶液)，对照组灌服等量的0.9%氯化钠溶液。分别在3，7，14，21 d处死大鼠。
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1.3.3免疫组化及HE染色 取大鼠左侧上颌骨，在4%多聚甲醛固定液(北京华越洋生物科技有限公司)固定24 h。在EDTA溶液中4℃脱钙50 d。PBS冲洗干净、石蜡包埋，与牙体长轴平行切片，取牙齿近远中组织切片免疫组化。①HE染色：烤片，二甲苯脱蜡25 min，苏木素侵泡3 min染色，淡氨水反蓝，冲洗，0.5%伊红侵泡2 min，冲洗，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。②免疫组化染色：烤片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，室温下使用复合酶消化液，滴加抗原修复液I，充分暴露抗原，用3%过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶活性，滴加二抗，DAB溶液显色，电镜下观察抗原抗体，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。
1.4评价标准 RANKL表达量用平均光密度值，每个组织切片随机分析片子上、中、下三个不同部位的高倍镜视野，测量其平均值，测量值越大，RANKL表达越多。观察免疫组化切片可见，RANKL的阳性表达集中在大鼠牙槽骨骨髓基质细胞中，胞膜、胞质及核膜都被染色，呈棕黄色颗粒状[4]。
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1.5统计学分析 使用GraphPad prism 5.0软件对数据统计分析，计量资料用(x±s)表示，比较采用t检验;计数资料以(%)表示，采用χ2检验。采取多因素方差方法分析比较时间和药物因素对RANKL表达的影响，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HE染色结果 动物实验模型初期，可见牙周膜纤维界限模糊不清，牙周纤维拉长。在第3天时可见破骨细胞以及成骨细胞团，牙根处牙周膜内可见成骨细胞(图1A、1B)，实验组牙周纤维排列规律，而对照组牙周纤维紊乱，但差异不明显。在第7天开始到第21天，牙周膜宽度逐渐缩小，纤维排列稳定，出现大量的成骨样细胞。对照组牙周纤维比较紊乱，存在成骨细胞的同时也存在大量的破骨样细胞。在保持的第21天，实验组可见细胞大部分处于稳定的状态且看到成骨细胞(图1D)，对照组牙周膜细胞排列紊乱(图1C)。
2.2免疫组织化学染色结果 RANKL因子主要表达在牙周膜及牙槽骨的细胞膜及细胞浆等部位，阳性的表达结果变现为黄色或黄棕色，淡蓝色为阴性表达，白色是底色。在保持开始到第7 d，可见RANKL因子大量表达(图2E、F)。随着保持时间延长，可见RANKL因子表达量逐渐降低，并且出现阴性表达。在保持第21 d对照组可见吸收陷窝(图G)，第21 d实验组RANKL因子表达量微乎其微并出现大部分淡蓝色阴性表达，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图H。, http://www.100md.com(宋佳 赵刚 宋春蕾)
口腔正畸治疗牙周病可以减轻患牙松动度、改善病患的出血情况，降低病患牙周袋深度[1]。但是正畸牙移动后，牙周膜纤维组织改建较慢并有恢复趋势，很容易使牙齿发生移动。目前对牙周病正畸治疗后保持阶段研究较少。中药骨碎补具有强骨、止痛的功效。现已被制成多种制剂用于牙齿松动、跌扑闪挫、筋骨折伤[2]。转录因子NF-KB受体活化剂配体(receptor activator of NF-kB ligand，RANKL)是参与骨改建的重要细胞因子之一。成骨細胞和基质细胞均表达RANKL和OPG，都能与破骨细胞表面的RANK结合，RANKL与破骨细胞细胞膜上的RANK结合，促进破骨细胞的分化成熟，并且抑制破骨细胞的凋亡[3]。本研究通过给患有牙周炎正畸牙移动保持阶段的大鼠灌服水煎骨碎补中药，用免疫组化检测RANKL因子的表达，探讨中药骨碎补在牙周炎正畸牙移动后保持阶段对牙周膜及牙槽骨的改建作用，为缩短牙周炎正畸患者保持时间提供实验依据。
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1.1材料 每2000 ml 水中加 20 g 骨碎补(购于黑龙江省佳木斯中医院)浸泡 30 min，加热至沸腾半个小时后滤渣，将滤液浓缩至 200 ml，即制成 100% 浓度的水煎剂。
1.2实验动物 选择清洁级Wistar大鼠，雄性，体重(180～220 g)45只[购于佳木斯大学动物实验中心，许可证号SCXK(黑)2013-001]，按照《实验动物保护条例》饲养，消毒，清理，喂养无菌饲料(由佳木斯动物实验中心提供)，饲养1周后开始动物实验。
1.3方法
1.3.1分组 按照随机数字表法将大鼠分成9个组，每组5只，进行标记。其中1组设为空白组，4组对照组，4组实验组。牙周炎组建立牙周炎模型，注射过量10%的水合氯醛处死，HE染色及免疫组化染色。实验组和对照组建立牙周炎及正畸牙移动模型，实验组灌服骨碎补水煎液，对照组灌服等量的0.9%氯化钠溶液。分别在第3，7，14，21 d处死，HE染色及免疫组化染色。
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1.3.2实验动物模型建立 牙周炎动物模型建立：用10%水合氯醛3.5 ml/kg(100 ml，雷根生物供应室，实验使用)，腹腔麻醉，仰卧位固定，上开口器(用0.9 mm不锈钢弯制)，用探针(口腔器械盒，保定市医疗器械有限公司)将大鼠上颌左侧第一磨牙牙龈剥离。在大鼠上颌左侧第一磨牙近中牙颈部龈沟处用快速手机(402高速手机，顺逊医疗器械)磨0.2 mm深固位沟，选用0.20 mm结扎丝(杭州奥索医疗器械有限公司)将大鼠上颌左侧第一磨牙结扎(尽量结扎到牙龈沟处)。给大鼠喂养高糖水(100 g/L)，将饲料(佳木斯大学动物实验中心提供)泡软，为期1个月。1个月观察可见上颌第一磨牙牙龈红肿、探诊出血、牙周袋，即牙周炎动物模型建立成功。
正畸牙移动模型建立：将大鼠麻醉，固定，大鼠上颌两颗中切牙颈部的远中面磨出深0.2 mm的固位沟，拉簧(镍钛合金牙齿矫形拉簧，北京圣玛科技有限公司)一侧连接大鼠磨牙，另一侧与大鼠切牙连接。测力计(杭州奥索牙用测力计杆式测力计，50/格)测拉力约50 g，加力21 d。建立保持期模型，用结扎丝连扎大鼠第一磨牙及切牙，保持第一磨牙移动后位置。在加力装置去除前1 d开始灌服。实验组灌服骨碎补水煎液(中医院购买，制备成0.9 g/kg溶液)，对照组灌服等量的0.9%氯化钠溶液。分别在3，7，14，21 d处死大鼠。
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1.3.3免疫组化及HE染色 取大鼠左侧上颌骨，在4%多聚甲醛固定液(北京华越洋生物科技有限公司)固定24 h。在EDTA溶液中4℃脱钙50 d。PBS冲洗干净、石蜡包埋，与牙体长轴平行切片，取牙齿近远中组织切片免疫组化。①HE染色：烤片，二甲苯脱蜡25 min，苏木素侵泡3 min染色，淡氨水反蓝，冲洗，0.5%伊红侵泡2 min，冲洗，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。②免疫组化染色：烤片，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，室温下使用复合酶消化液，滴加抗原修复液I，充分暴露抗原，用3%过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶活性，滴加二抗，DAB溶液显色，电镜下观察抗原抗体，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。
1.4评价标准 RANKL表达量用平均光密度值，每个组织切片随机分析片子上、中、下三个不同部位的高倍镜视野，测量其平均值，测量值越大，RANKL表达越多。观察免疫组化切片可见，RANKL的阳性表达集中在大鼠牙槽骨骨髓基质细胞中，胞膜、胞质及核膜都被染色，呈棕黄色颗粒状[4]。
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1.5统计学分析 使用GraphPad prism 5.0软件对数据统计分析，计量资料用(x±s)表示，比较采用t检验;计数资料以(%)表示，采用χ2检验。采取多因素方差方法分析比较时间和药物因素对RANKL表达的影响，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 HE染色结果 动物实验模型初期，可见牙周膜纤维界限模糊不清，牙周纤维拉长。在第3天时可见破骨细胞以及成骨细胞团，牙根处牙周膜内可见成骨细胞(图1A、1B)，实验组牙周纤维排列规律，而对照组牙周纤维紊乱，但差异不明显。在第7天开始到第21天，牙周膜宽度逐渐缩小，纤维排列稳定，出现大量的成骨样细胞。对照组牙周纤维比较紊乱，存在成骨细胞的同时也存在大量的破骨样细胞。在保持的第21天，实验组可见细胞大部分处于稳定的状态且看到成骨细胞(图1D)，对照组牙周膜细胞排列紊乱(图1C)。
2.2免疫组织化学染色结果 RANKL因子主要表达在牙周膜及牙槽骨的细胞膜及细胞浆等部位，阳性的表达结果变现为黄色或黄棕色，淡蓝色为阴性表达，白色是底色。在保持开始到第7 d，可见RANKL因子大量表达(图2E、F)。随着保持时间延长，可见RANKL因子表达量逐渐降低，并且出现阴性表达。在保持第21 d对照组可见吸收陷窝(图G)，第21 d实验组RANKL因子表达量微乎其微并出现大部分淡蓝色阴性表达，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图H。, http://www.100md.com(宋佳 赵刚 宋春蕾)