干扰素-γ对乳腺癌细胞HLA-Ⅰ分子表达的影响(2)
1材料与方法
1.1药品与试剂 DMEM细胞培养基、胰酶、PBS购买自美国Gibco公司和胎牛血清购买自以色列BI公司。IFN-γ购于美国peprotech公司;HLA-ABC抗体购于天津三箭生物公司;HLA-ABC以及GAPDH引物购自Invitrogen公司。SKBR3乳腺癌细胞为本实验室保存。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养 将乳腺癌SKBR3细胞以DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)，置于5% 的CO2恒温恒湿培养箱中培养，待细胞密度达到90%左右时传代。弃去旧的细胞培养基，PBS漂洗细胞2次，3 ml 0.25%胰蛋白酶消化1.5 min，吸去胰酶，加入10%胎牛血清DMEM培养基3 ml吹打成单细胞悬液，将细胞悬液传至3个新培养瓶中，加入5 ml10%胎牛血清DMEM完全培养基继续培养。
1.2.2荧光定量PCR 实时荧光定量PCR实验组分别加入终浓度为25 U/ml、50 U/ml、100 U/ml IFN-γ，未加药物组为空白对照组。用TRIzol抽提各组细胞总RNA。按照Thermo逆转录试剂盒说明书配置实验反应液，反转录反应参数为：42℃1 h;72℃5 min。qPCR循环参数为：95℃预变性10 s后，随后按60℃30 s，72℃20 s进行45个循环;实验以GAPDH基因内参表达水平为对照，以2-△△Ct法分析细胞中HLA-Ⅰ类分子的mRNA表达水平。扩增HLA-I基因引物：正向引物：5'-GCTACTACAACCAGAGCGAGG-3'，反向引物：5'-GTGTGATCTCCGCAGGGTAGA-3';扩增GAPDH基因引物：正向引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反向引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。实验重复3次。
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1.2.3流式细胞术检测细胞表面HLA-Ⅰ类分子 药物处理同荧光定量PCR。将各组细胞制成细胞悬液，用含1%胎牛血清的PBS漂洗3次。调整每组细胞浓度为1×107个/ml。将每组细胞悬液分2管，每管 25 μl，其中一管加HLA-Ⅰ FITC 单抗1.5 μl。另一管加入同型对照1.5 μl。室温避光反应 40 min。加入1%胎牛血清PBS 400μl/管。采用流式免疫荧光法(FACS)检测样品，每管样品分析5000个细胞。实验重复3次。
1.3统計学分析 所有数据采用SPSS 21.0 统计学软件进行统计，计量资料采用(x±s)表示，行单因素方差分析，组间比较用Tukey检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 IFN-γ对SKBR3乳腺癌细胞的HLA-Ⅰ mRNA水平的影响 实时荧光定量PCR结果显示IFN-γ处理组细胞 HLA-Ⅰ mRNA 表达量高于空白对照组(P<0.05)，100 U/ml组最高。且HLA-ⅠmRNA 表达量随着IFN-γ浓度的增加而增加，表明这个浓度区间中，IFN-γ有诱导乳腺癌SKBR3细胞HLA-ⅠmRNA的作用，具有浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
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2.2 IFN-γ对SKBR3乳腺癌细胞表面的HLA-Ⅰ蛋白表达的影响 流式细胞免疫荧光检测显示，经25、50、100 U/ml IFN-γ处理的SKBR3细胞表面的HLA-I的表达量高于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。且随着IFN-γ浓度的增高，细胞表面HLA-Ⅰ的表达量增高，具有浓度依赖性，见表2。
3讨论
免疫应答(Immune response)是指机体免疫系统对体内抗原进行识别，继而清除抗原的一系列生物
学效应过程。T细胞是人体细胞免疫的主要细胞之一，在抗肿瘤免疫机制中发挥着主导作用。肿瘤细胞表面免疫抗原的丢失是肿瘤细胞逃避机体免疫的主要原因之一，在肿瘤的发生发展中起着关键作用。提高肿瘤表面的免疫抗原表达可增强肿瘤细胞的免疫源性，同时提高T细胞对肿瘤细胞识别度，达到抗肿瘤的作用。HLA-Ⅰ参与人类免疫细胞识别肿瘤抗原，在多种人类肿瘤细胞中存在着HLA-Ⅰ抗原的缺失。吴明雨等[4]研究发现低分化型口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织HLA-B表达较正常组织和高分化OSCC明显下调，可能与低分化型OSCC出现较高的淋巴道转移率相关，提示HLA-B的表达下调可能在OSCC淋巴道转移中有着重要意义。同时，HLA-B可作为一项监测口腔鳞状细胞癌恶性程度与淋巴道转移的指标。纪晓坤等[5]发现在人卵巢癌SKOV3细胞转染Beclin1质粒后HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ表达量增加，使卵巢癌细胞免疫应答增强。Chang C等[6]报道大部分肿瘤中均存在 HLA-Ⅰ表达异常，并在对100多种肿瘤性损伤的研究中发现16%～80%的损伤均出现HLA-Ⅰ的表达缺失或下降。由此可见HLA-Ⅰ分子的表达对肿瘤的发生、发展有关键作用。近些年来兴起的肿瘤免疫疗法较传统治疗方法可显著提高患者的生存质量。目前对乳腺癌的免疫疗法的研究相对较少。IFN-γ作为重要的天然免疫调节剂，可上调多种肿瘤细胞表面免疫分子的表达，从而增强免疫细胞的抗原提呈作用，使Th0细胞向Th1分化[7]。同时，IFN-γ还可刺激APCs细胞，上调IL-12、IL-27和CD86等的表达，促进了Th1细胞的分化和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能。此外，IFN-γ可干扰Th2，Th17、调节性T细胞(Treg)等在肿瘤细胞免疫逃避过程中起关键作用的细胞的分化[8]。李林卿等[9]在对271例乳腺癌手术患者的癌组织的检测中发现其中有92例患者的乳腺癌组织中HLA-Ⅰ呈强阳性表达，而179 例表达下调;且HLA-Ⅰ的表达量与TNM分期早晚、有无淋巴结转移及血管侵犯均相关。HLA-Ⅰ表达下调者的无病生存率显著低于HLA-Ⅰ表达阳性者。说明HLA-Ⅰ分子的表达与乳腺癌的发生和进展有着重要的相关性。研究表明IFN-γ可抑制多种肿瘤细胞系生长(包括乳腺癌细胞)，而且对乳腺癌皮肤复发患者进行病灶内注射IFN-γ可使皮肤损伤部分或完全消退[10]。但是其抗肿瘤作用机制尚未完全清楚。据以往的研究发现[11，12]，IFN-γ可上调结肠癌细胞、胃癌细胞表面HLA-Ⅰ分子表达。但对乳腺癌细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的作用有待进一步研究。, http://www.100md.com(刘丽 孙立新 赵明珍)
1.1药品与试剂 DMEM细胞培养基、胰酶、PBS购买自美国Gibco公司和胎牛血清购买自以色列BI公司。IFN-γ购于美国peprotech公司;HLA-ABC抗体购于天津三箭生物公司;HLA-ABC以及GAPDH引物购自Invitrogen公司。SKBR3乳腺癌细胞为本实验室保存。
1.2实验方法
1.2.1细胞培养 将乳腺癌SKBR3细胞以DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)，置于5% 的CO2恒温恒湿培养箱中培养，待细胞密度达到90%左右时传代。弃去旧的细胞培养基，PBS漂洗细胞2次，3 ml 0.25%胰蛋白酶消化1.5 min，吸去胰酶，加入10%胎牛血清DMEM培养基3 ml吹打成单细胞悬液，将细胞悬液传至3个新培养瓶中，加入5 ml10%胎牛血清DMEM完全培养基继续培养。
1.2.2荧光定量PCR 实时荧光定量PCR实验组分别加入终浓度为25 U/ml、50 U/ml、100 U/ml IFN-γ，未加药物组为空白对照组。用TRIzol抽提各组细胞总RNA。按照Thermo逆转录试剂盒说明书配置实验反应液，反转录反应参数为：42℃1 h;72℃5 min。qPCR循环参数为：95℃预变性10 s后，随后按60℃30 s，72℃20 s进行45个循环;实验以GAPDH基因内参表达水平为对照，以2-△△Ct法分析细胞中HLA-Ⅰ类分子的mRNA表达水平。扩增HLA-I基因引物：正向引物：5'-GCTACTACAACCAGAGCGAGG-3'，反向引物：5'-GTGTGATCTCCGCAGGGTAGA-3';扩增GAPDH基因引物：正向引物：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反向引物：5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。实验重复3次。
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1.2.3流式细胞术检测细胞表面HLA-Ⅰ类分子 药物处理同荧光定量PCR。将各组细胞制成细胞悬液，用含1%胎牛血清的PBS漂洗3次。调整每组细胞浓度为1×107个/ml。将每组细胞悬液分2管，每管 25 μl，其中一管加HLA-Ⅰ FITC 单抗1.5 μl。另一管加入同型对照1.5 μl。室温避光反应 40 min。加入1%胎牛血清PBS 400μl/管。采用流式免疫荧光法(FACS)检测样品，每管样品分析5000个细胞。实验重复3次。
1.3统計学分析 所有数据采用SPSS 21.0 统计学软件进行统计，计量资料采用(x±s)表示，行单因素方差分析，组间比较用Tukey检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 IFN-γ对SKBR3乳腺癌细胞的HLA-Ⅰ mRNA水平的影响 实时荧光定量PCR结果显示IFN-γ处理组细胞 HLA-Ⅰ mRNA 表达量高于空白对照组(P<0.05)，100 U/ml组最高。且HLA-ⅠmRNA 表达量随着IFN-γ浓度的增加而增加，表明这个浓度区间中，IFN-γ有诱导乳腺癌SKBR3细胞HLA-ⅠmRNA的作用，具有浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
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2.2 IFN-γ对SKBR3乳腺癌细胞表面的HLA-Ⅰ蛋白表达的影响 流式细胞免疫荧光检测显示，经25、50、100 U/ml IFN-γ处理的SKBR3细胞表面的HLA-I的表达量高于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05)。且随着IFN-γ浓度的增高，细胞表面HLA-Ⅰ的表达量增高，具有浓度依赖性，见表2。
3讨论
免疫应答(Immune response)是指机体免疫系统对体内抗原进行识别，继而清除抗原的一系列生物
学效应过程。T细胞是人体细胞免疫的主要细胞之一，在抗肿瘤免疫机制中发挥着主导作用。肿瘤细胞表面免疫抗原的丢失是肿瘤细胞逃避机体免疫的主要原因之一，在肿瘤的发生发展中起着关键作用。提高肿瘤表面的免疫抗原表达可增强肿瘤细胞的免疫源性，同时提高T细胞对肿瘤细胞识别度，达到抗肿瘤的作用。HLA-Ⅰ参与人类免疫细胞识别肿瘤抗原，在多种人类肿瘤细胞中存在着HLA-Ⅰ抗原的缺失。吴明雨等[4]研究发现低分化型口腔鳞状细胞癌(OSCC)组织HLA-B表达较正常组织和高分化OSCC明显下调，可能与低分化型OSCC出现较高的淋巴道转移率相关，提示HLA-B的表达下调可能在OSCC淋巴道转移中有着重要意义。同时，HLA-B可作为一项监测口腔鳞状细胞癌恶性程度与淋巴道转移的指标。纪晓坤等[5]发现在人卵巢癌SKOV3细胞转染Beclin1质粒后HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ表达量增加，使卵巢癌细胞免疫应答增强。Chang C等[6]报道大部分肿瘤中均存在 HLA-Ⅰ表达异常，并在对100多种肿瘤性损伤的研究中发现16%～80%的损伤均出现HLA-Ⅰ的表达缺失或下降。由此可见HLA-Ⅰ分子的表达对肿瘤的发生、发展有关键作用。近些年来兴起的肿瘤免疫疗法较传统治疗方法可显著提高患者的生存质量。目前对乳腺癌的免疫疗法的研究相对较少。IFN-γ作为重要的天然免疫调节剂，可上调多种肿瘤细胞表面免疫分子的表达，从而增强免疫细胞的抗原提呈作用，使Th0细胞向Th1分化[7]。同时，IFN-γ还可刺激APCs细胞，上调IL-12、IL-27和CD86等的表达，促进了Th1细胞的分化和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能。此外，IFN-γ可干扰Th2，Th17、调节性T细胞(Treg)等在肿瘤细胞免疫逃避过程中起关键作用的细胞的分化[8]。李林卿等[9]在对271例乳腺癌手术患者的癌组织的检测中发现其中有92例患者的乳腺癌组织中HLA-Ⅰ呈强阳性表达，而179 例表达下调;且HLA-Ⅰ的表达量与TNM分期早晚、有无淋巴结转移及血管侵犯均相关。HLA-Ⅰ表达下调者的无病生存率显著低于HLA-Ⅰ表达阳性者。说明HLA-Ⅰ分子的表达与乳腺癌的发生和进展有着重要的相关性。研究表明IFN-γ可抑制多种肿瘤细胞系生长(包括乳腺癌细胞)，而且对乳腺癌皮肤复发患者进行病灶内注射IFN-γ可使皮肤损伤部分或完全消退[10]。但是其抗肿瘤作用机制尚未完全清楚。据以往的研究发现[11，12]，IFN-γ可上调结肠癌细胞、胃癌细胞表面HLA-Ⅰ分子表达。但对乳腺癌细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的作用有待进一步研究。, http://www.100md.com(刘丽 孙立新 赵明珍)