可手术的非小细胞肺癌患者外周静脉血cfDNA总浓度及长片段DNA浓度的临床价值研究(2)
Key words：Non-small cell lung cancer;Total concentration of peripheral blood cfDNA;Long fragment DNA concentration
肺癌(lung cancer)已成为恶性肿瘤相关死亡的首要原因[1]，在我国公布的统计数据中：2015年肺癌发病率及死亡率均位居恶性肿瘤首位[2]，其中非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%。外周静脉血cfDNA是指游离于人体静脉血液中的脱氧核糖核苷酸，目前已证实在健康人的血液中，cfDNA主要来自凋亡细胞，几乎不来自坏死细胞[3]，而肿瘤患者血液中的cfDNA只有小部分来自于凋亡细胞，而绝大部分来自于肿瘤细胞主动释放的DNA及肿瘤坏死溶解产生的DNA[4]。有实验研究表明，恶性肿瘤患者外周静脉血中cfDNA总浓度明显高于健康人，长片段DNA作为cfDNA中最具有代表性的检验指标，可间接反映体内肿瘤负荷的变化[5]。为此，本研究采用QPCR法定量检测非小细胞肺癌患者外周静脉血中cfDNA总浓度及长片段DNA浓度，并与同期健康人群作对比，以探究其與非小细胞肺癌患者肿瘤负荷的关系。
, 百拇医药
1资料与方法
1.1 一般资料 选取2017年1月～12月承德市中心医院胸外科收治的可手术切除的非小细胞肺癌患者60例为实验组，其中男45例，女15例，年龄45～65岁，平均年龄(56.58±3.35)岁。本研究经我院伦理委员会审批通过，所有患者自愿加入并签署知情同意书。纳入标准：①原发性肺癌，初诊、初治、可手术切除且术前活检病理考虑为非小细胞肺癌或临床诊断为肺恶性肿瘤且经术后病理证实的患者;②无急性炎症、创伤、脱水及剧烈运动等情况;③若手术前入实验组手术后病理证实为小细胞肺癌、转移癌及肺部良性肿物者剔除。选择同期于承德市中心医院体检中心健康体检者60例为对照组，其中男45例，女15例，年龄45～65岁，平均年龄(54.58±2.10)岁，纳入标准：①体检后随访6个月内未发现肿瘤或癌前病变;②无急性炎症、创伤、脱水及剧烈运动等情况。两组的排除标准：①感染性疾病的患者;②系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身免疫性疾病的患者;③接受器官移植及血液系统疾病的患者;④脑出血、脑梗死、心肌梗死、肺栓塞的患者;⑤妊娠期患者;⑥术前行新辅助放疗、化疗、免疫治疗的患者。两组年龄、性别等基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，研究可比。
, 百拇医药
1.2仪器与方法 ①标本的采集：用EDTA抗凝管分别采集两组研究对象外周静脉血液10 ml;②实验血浆制备：将所采集标本放入离心机(TGL-20型)中以1600 rpm离心10 min，小心吸取淡黄色血浆上清到新的离心管中再用16000 rpm离心10 min，获得血浆样品;③血浆直接扩增模板准备：将血浆样品用Tris-EDTA缓冲液进行10倍稀释后作为血浆直接扩增模板备用。④标准品的稀释：先将Human DNA Standard(100 ng/μl)用Stock Diluent，SDB稀释5倍至浓度为20 ng/μl的Stock，再稀释20倍得到浓度为1.0 ng/μl的标准品，再将所得的标准品依次稀释4倍，共稀释6次，得到浓度由1.0 ng/μl至0.000244141 ng/μl的7个不同浓度的标准品。⑤QPCR反应体系配制及反应：根据所需要配制的孔数行反应体系配制，分别配出需要量的目的片段以及内参照Internal PCR Control(IPC)的反应体系混合物。2 μl血浆的模板DNA、2X SYBR GREEN MASTER MIX、1 mM每种dNTP、0.2 μm引物，上述为25 μl体系，不足部分用去核酸酶水补齐。引物1(总浓度，human LINE-1 family，97 bp)：正向： 5'-tggcacatatacaccatggaa-3'、反向： 5'- tgagaatgatggtttccaatttc-3'[6]。引物 2(长片段浓度，human LINE-1 family，300 bp)：正向： 5'-ACACCTATTCCAAAATTGACCAC-3'、反向：5'-TTCCCTCTACACACTGCTTTGA-3'[7]。QPCR反应程序：预变性，95℃，1 min;变性， 95℃，8 s;退火/延伸 60℃，15 s;变性，退火/延伸，35个循环，进行实时定量PCR检测。
, http://www.100md.com
1.3观察指标 比较实验组术前1 d与对照组外周静脉血中cfNDA总浓度及长片段DNA浓度情况;比较实验组术前1 d、术后7 d、术后20 d外周静脉血中cfNDA总浓度及长片段DNA浓度变化情况。
1.4统计学分析 采用SPSS 21.0统计学软件对实验检测结果进行分析，计量资料以(x±s)表示，组间比较采用两个独立样本t检验，实验组手术前后不同时间段数据比较采用配对样本t检验，检验水准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组外周静脉血中cfNDA总浓度比较 实验组患者术前1 d外周静脉血中cfDNA总浓度高于对照组(t=9.519，P=0.000)，实验组患者术后7 d外周静脉血中cfDNA总浓度较术前1 d无明显变化(t=0.161，P=0.873)，实验组患者术后20 d外周静脉血中cfDNA总浓度较术前1 d、术后7 d下降(t=2.594，P=0.012;t=2.668，P=0.010)，见表1。
2.2两组血浆长片段DNA浓度比较 实验组患者术前1 d外周静脉血中长片段DNA浓度高于对照组(t=9.366，P=0.000)，实验组患者术后7 d外周静脉血中长片段DNA浓度与术前1 d无明显变化(t=0.546，P=0.587)，实验组患者术后20 d外周静脉血中长片段DNA浓度较术前1 d、术后7 d下降(t=2.280，P=0.026;t=2.964，P=0.004)，见表2。, 百拇医药(贾殿军 王利军 程险峰)
肺癌(lung cancer)已成为恶性肿瘤相关死亡的首要原因[1]，在我国公布的统计数据中：2015年肺癌发病率及死亡率均位居恶性肿瘤首位[2]，其中非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%。外周静脉血cfDNA是指游离于人体静脉血液中的脱氧核糖核苷酸，目前已证实在健康人的血液中，cfDNA主要来自凋亡细胞，几乎不来自坏死细胞[3]，而肿瘤患者血液中的cfDNA只有小部分来自于凋亡细胞，而绝大部分来自于肿瘤细胞主动释放的DNA及肿瘤坏死溶解产生的DNA[4]。有实验研究表明，恶性肿瘤患者外周静脉血中cfDNA总浓度明显高于健康人，长片段DNA作为cfDNA中最具有代表性的检验指标，可间接反映体内肿瘤负荷的变化[5]。为此，本研究采用QPCR法定量检测非小细胞肺癌患者外周静脉血中cfDNA总浓度及长片段DNA浓度，并与同期健康人群作对比，以探究其與非小细胞肺癌患者肿瘤负荷的关系。
, 百拇医药
1资料与方法
1.1 一般资料 选取2017年1月～12月承德市中心医院胸外科收治的可手术切除的非小细胞肺癌患者60例为实验组，其中男45例，女15例，年龄45～65岁，平均年龄(56.58±3.35)岁。本研究经我院伦理委员会审批通过，所有患者自愿加入并签署知情同意书。纳入标准：①原发性肺癌，初诊、初治、可手术切除且术前活检病理考虑为非小细胞肺癌或临床诊断为肺恶性肿瘤且经术后病理证实的患者;②无急性炎症、创伤、脱水及剧烈运动等情况;③若手术前入实验组手术后病理证实为小细胞肺癌、转移癌及肺部良性肿物者剔除。选择同期于承德市中心医院体检中心健康体检者60例为对照组，其中男45例，女15例，年龄45～65岁，平均年龄(54.58±2.10)岁，纳入标准：①体检后随访6个月内未发现肿瘤或癌前病变;②无急性炎症、创伤、脱水及剧烈运动等情况。两组的排除标准：①感染性疾病的患者;②系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身免疫性疾病的患者;③接受器官移植及血液系统疾病的患者;④脑出血、脑梗死、心肌梗死、肺栓塞的患者;⑤妊娠期患者;⑥术前行新辅助放疗、化疗、免疫治疗的患者。两组年龄、性别等基线资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，研究可比。
, 百拇医药
1.2仪器与方法 ①标本的采集：用EDTA抗凝管分别采集两组研究对象外周静脉血液10 ml;②实验血浆制备：将所采集标本放入离心机(TGL-20型)中以1600 rpm离心10 min，小心吸取淡黄色血浆上清到新的离心管中再用16000 rpm离心10 min，获得血浆样品;③血浆直接扩增模板准备：将血浆样品用Tris-EDTA缓冲液进行10倍稀释后作为血浆直接扩增模板备用。④标准品的稀释：先将Human DNA Standard(100 ng/μl)用Stock Diluent，SDB稀释5倍至浓度为20 ng/μl的Stock，再稀释20倍得到浓度为1.0 ng/μl的标准品，再将所得的标准品依次稀释4倍，共稀释6次，得到浓度由1.0 ng/μl至0.000244141 ng/μl的7个不同浓度的标准品。⑤QPCR反应体系配制及反应：根据所需要配制的孔数行反应体系配制，分别配出需要量的目的片段以及内参照Internal PCR Control(IPC)的反应体系混合物。2 μl血浆的模板DNA、2X SYBR GREEN MASTER MIX、1 mM每种dNTP、0.2 μm引物，上述为25 μl体系，不足部分用去核酸酶水补齐。引物1(总浓度，human LINE-1 family，97 bp)：正向： 5'-tggcacatatacaccatggaa-3'、反向： 5'- tgagaatgatggtttccaatttc-3'[6]。引物 2(长片段浓度，human LINE-1 family，300 bp)：正向： 5'-ACACCTATTCCAAAATTGACCAC-3'、反向：5'-TTCCCTCTACACACTGCTTTGA-3'[7]。QPCR反应程序：预变性，95℃，1 min;变性， 95℃，8 s;退火/延伸 60℃，15 s;变性，退火/延伸，35个循环，进行实时定量PCR检测。
, http://www.100md.com
1.3观察指标 比较实验组术前1 d与对照组外周静脉血中cfNDA总浓度及长片段DNA浓度情况;比较实验组术前1 d、术后7 d、术后20 d外周静脉血中cfNDA总浓度及长片段DNA浓度变化情况。
1.4统计学分析 采用SPSS 21.0统计学软件对实验检测结果进行分析，计量资料以(x±s)表示，组间比较采用两个独立样本t检验，实验组手术前后不同时间段数据比较采用配对样本t检验，检验水准为α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1两组外周静脉血中cfNDA总浓度比较 实验组患者术前1 d外周静脉血中cfDNA总浓度高于对照组(t=9.519，P=0.000)，实验组患者术后7 d外周静脉血中cfDNA总浓度较术前1 d无明显变化(t=0.161，P=0.873)，实验组患者术后20 d外周静脉血中cfDNA总浓度较术前1 d、术后7 d下降(t=2.594，P=0.012;t=2.668，P=0.010)，见表1。
2.2两组血浆长片段DNA浓度比较 实验组患者术前1 d外周静脉血中长片段DNA浓度高于对照组(t=9.366，P=0.000)，实验组患者术后7 d外周静脉血中长片段DNA浓度与术前1 d无明显变化(t=0.546，P=0.587)，实验组患者术后20 d外周静脉血中长片段DNA浓度较术前1 d、术后7 d下降(t=2.280，P=0.026;t=2.964，P=0.004)，见表2。, 百拇医药(贾殿军 王利军 程险峰)