肺癌患者血浆检测肿瘤标志物的分析方法及展望(1)
摘要：非小细胞肺癌(NSCLC)患者进行靶向治疗前需要鉴定多种生物标志物，包括EGFR、ALK、ROS-1和PD-L1，通常经手术、穿刺等途径获取样本。液体检测是目前新兴的肿瘤标记物检测方法，它可以从血浆中提取出循环系统中的肿瘤DNA(ctDNA)，具有低风险、取样简单、术后不适感少等优点。常用的液体活检方法有定量聚合酶链反应(PCR)、数字PCR技术、新一代测序技术(NGS)。本文简要地阐述了上述分析方法的研究进展及未来应用方向。
关键词：肺癌;肿瘤标志物;液体检测
中图分类号：R734.2 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.07.014
文章编号：1006-1959(2019)07-0039-05
, 百拇医药
Abstract：Non-small cell lung cancer (NSCLC) patients need to identify a variety of biomarkers， including EGFR， ALK， ROS-1 and PD-L1， before they are targeted. Usually， the samples are obtained by surgery， puncture and other means. Liquid detection is an emerging method for detecting tumor markers. It can extract tumor DNA (ctDNA) from the circulatory system from plasma， and has the advantages of low risk， simple sampling， and less postoperative discomfort. Commonly used liquid biopsy methods are quantitative polymerase chain reaction (PCR)， digital PCR technology， and next-generation sequencing technology (NGS). This paper briefly describes the research progress and future application directions of the above analytical methods.
, 百拇医药
Key words：Lung cancer;Tumor markers;Liquid detection
目前个体化医疗模式已经彻底改变了肺癌的诊断和治疗方式。明确肿瘤病理类型，采取相应最佳治疗方案是肺癌治疗的基本准则。生物标志物的检测对于免疫、靶向等治疗至关重要，其中包括目前比较热门的EGFR、ALK和ROS -1等。虽然肺癌的诊断和治疗方面已经取得了重大进展，但肺癌的延迟诊断问题日益凸显[1]。晚期(ⅢB-Ⅳ)非小细胞肺癌(NSCLC)患者在肺癌分期总人群中占有更高比例。细胞学标本或组织是唯一可用于形态学诊断和分子评估的材料[2，3]。据统计，高达30%的晚期NSCLC患者难以获取有效活组织标本[4]。在此条件下进行标志物检测极具挑战性而非侵入性“液体活检”技术可以避免上述问题，并且具有应用范围广、快速高效、低操作风险等优势[5]。血浆来源的循环肿瘤DNA(ctDNA)是目前许多研究用于非小细胞肺癌患者的主要样本来源[6-11]，通过液体活检技术对血浆ctDNA进行EGFR检测;应用血浆ctDNA检测外显子20 EGFR点突变(p.T790M)的耐药情况。上述实验表明液体活检技术可以用于指导酪氨酸激酶抑制剂(TKI)用药。主要缺点是血液样本中ctDNA含量较低，仅占总细胞游离DNA的<0.5%[12]。因此需要提高灵敏度技术避免假阴性风险、详细的临床验证减少假阳性情况的发生。本综述的目的是提供目前用于肺癌患者ctDNA分析临床实践方法的最新信息。
, http://www.100md.com
1 ctDNA的检测方法
1.1 ctDNA的收集和提取 液体活检获得数据质量的高低取决于以下3个关键步骤：抽血、ctDNA离心和ctDNA提取。
抽血和血浆分离的间隔时间至关重要[13]，在同一实验室内分析样本有助于缩短抽血、ctDNA离心和ctDNA提取之间的周转时间。采集管建议使用含EDTA的试管(Vacutainer，BD，Plymouth，UK)以避免凝血，采血量最多10 ml。在外部机构中收集样本时，建议使用具有不含甲醛的防腐剂、减少非肿瘤循环细胞释放基因组DNA、抑制ctDNA降解、在室温下储存样品等优点的PAXgene Blood DNA管(Qiagen，Hilden，Germany)或Cell-Free DNA BCT管(Streck，La Vista，NE，USA)[14，15]。Toro PV等的研究所证明[14]，BCT管可以防止细胞在抽血后7 d内溶解，效果较PAXgene管好。
, 百拇医药
采血后关键点在于收集后1 h内离心血浆。ctDNA具有15 min的半衰期，快速离心能确保获取的血浆和/或血清中具有足够量的ctDNA，避免假阴性的风险。通常可进行2次离心(2300 rpm，10 min)获得1.2 ml血浆。也有关于3次离心的报道，如Page K等[16]进行3次离心(条件依次为：1000 g，4℃ 10 min;1000 g或2000 g或10000 g，4℃，10 min;1000 g，室溫，5 min。有研究对11种提取ctDNA的方法进行评估[17，18]，其推荐3种具有高准确度和重复性的试剂盒：QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen)、Norgen血浆/血清循环DNA纯化迷你试剂盒、Norgen lasma / Serum无细胞循环DNA纯化迷你试剂盒(Norgen，Thorold，ON，Canada)。, 百拇医药(魏优蕾 郭晓彤)
关键词：肺癌;肿瘤标志物;液体检测
中图分类号：R734.2 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.07.014
文章编号：1006-1959(2019)07-0039-05
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Abstract：Non-small cell lung cancer (NSCLC) patients need to identify a variety of biomarkers， including EGFR， ALK， ROS-1 and PD-L1， before they are targeted. Usually， the samples are obtained by surgery， puncture and other means. Liquid detection is an emerging method for detecting tumor markers. It can extract tumor DNA (ctDNA) from the circulatory system from plasma， and has the advantages of low risk， simple sampling， and less postoperative discomfort. Commonly used liquid biopsy methods are quantitative polymerase chain reaction (PCR)， digital PCR technology， and next-generation sequencing technology (NGS). This paper briefly describes the research progress and future application directions of the above analytical methods.
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Key words：Lung cancer;Tumor markers;Liquid detection
目前个体化医疗模式已经彻底改变了肺癌的诊断和治疗方式。明确肿瘤病理类型，采取相应最佳治疗方案是肺癌治疗的基本准则。生物标志物的检测对于免疫、靶向等治疗至关重要，其中包括目前比较热门的EGFR、ALK和ROS -1等。虽然肺癌的诊断和治疗方面已经取得了重大进展，但肺癌的延迟诊断问题日益凸显[1]。晚期(ⅢB-Ⅳ)非小细胞肺癌(NSCLC)患者在肺癌分期总人群中占有更高比例。细胞学标本或组织是唯一可用于形态学诊断和分子评估的材料[2，3]。据统计，高达30%的晚期NSCLC患者难以获取有效活组织标本[4]。在此条件下进行标志物检测极具挑战性而非侵入性“液体活检”技术可以避免上述问题，并且具有应用范围广、快速高效、低操作风险等优势[5]。血浆来源的循环肿瘤DNA(ctDNA)是目前许多研究用于非小细胞肺癌患者的主要样本来源[6-11]，通过液体活检技术对血浆ctDNA进行EGFR检测;应用血浆ctDNA检测外显子20 EGFR点突变(p.T790M)的耐药情况。上述实验表明液体活检技术可以用于指导酪氨酸激酶抑制剂(TKI)用药。主要缺点是血液样本中ctDNA含量较低，仅占总细胞游离DNA的<0.5%[12]。因此需要提高灵敏度技术避免假阴性风险、详细的临床验证减少假阳性情况的发生。本综述的目的是提供目前用于肺癌患者ctDNA分析临床实践方法的最新信息。
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1 ctDNA的检测方法
1.1 ctDNA的收集和提取 液体活检获得数据质量的高低取决于以下3个关键步骤：抽血、ctDNA离心和ctDNA提取。
抽血和血浆分离的间隔时间至关重要[13]，在同一实验室内分析样本有助于缩短抽血、ctDNA离心和ctDNA提取之间的周转时间。采集管建议使用含EDTA的试管(Vacutainer，BD，Plymouth，UK)以避免凝血，采血量最多10 ml。在外部机构中收集样本时，建议使用具有不含甲醛的防腐剂、减少非肿瘤循环细胞释放基因组DNA、抑制ctDNA降解、在室温下储存样品等优点的PAXgene Blood DNA管(Qiagen，Hilden，Germany)或Cell-Free DNA BCT管(Streck，La Vista，NE，USA)[14，15]。Toro PV等的研究所证明[14]，BCT管可以防止细胞在抽血后7 d内溶解，效果较PAXgene管好。
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采血后关键点在于收集后1 h内离心血浆。ctDNA具有15 min的半衰期，快速离心能确保获取的血浆和/或血清中具有足够量的ctDNA，避免假阴性的风险。通常可进行2次离心(2300 rpm，10 min)获得1.2 ml血浆。也有关于3次离心的报道，如Page K等[16]进行3次离心(条件依次为：1000 g，4℃ 10 min;1000 g或2000 g或10000 g，4℃，10 min;1000 g，室溫，5 min。有研究对11种提取ctDNA的方法进行评估[17，18]，其推荐3种具有高准确度和重复性的试剂盒：QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen)、Norgen血浆/血清循环DNA纯化迷你试剂盒、Norgen lasma / Serum无细胞循环DNA纯化迷你试剂盒(Norgen，Thorold，ON，Canada)。, 百拇医药(魏优蕾 郭晓彤)