p16与ER在乳腺癌中表达的相关性(2)
1材料与方法
1.1一般资料 收集常州市第一人民医院2016年5月～2018年6月手术治疗的乳腺癌石蜡标本181例，经病理检测证实全部为浸润性导管癌。患者全部为女性，年龄24～88岁，中位年龄52岁;组织学分级(WHO分标准)级：Ⅰ级30例、Ⅱ级87例、Ⅲ级64例;淋巴结转移：62例淋巴结(腋窝)转移数>3，119例为0～3;临床分期(TNM)：Ⅰ、Ⅱ合并为112例，Ⅲ为69例。所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。p16抗体(BS1265，Bioworld公司);ER单克隆抗体、SP试剂盒(ZA-0102、SP9000，北京中衫金桥公司)。
1.2方法
1.2.1 ER和p16的检测 使用免疫组织化学染色(SP法)，具体步骤为：将5 μm石蜡切片置于65℃烤箱中，过夜孵育;二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，去离子水冲洗5 min，蒸馏水冲洗2遍;采用pH 6.0的柠檬酸溶液进行抗原修复;加入100 μl稀释好的一抗(1∶200稀释)，室温下孵育1 h，PBS缓冲液冲洗3次;去掉PBS液后，每张切片再加入100 μl稀释好的二抗(1∶300稀释)，在室温下孵育15 min，PBS缓冲液冲洗3次;二氨基联苯胺显色，在显微镜下检验染色质量，最后用中性树胶封片。阴性对照采用PBS缓冲液代替一抗。阳性标准：p16以细胞核和(或)胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数≥10%计为阳性[5]，组织内淋巴细胞或正常的乳腺导管上皮为阳性内对照;ER以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数≥1%计为阳性[6]。
, 百拇医药
1.2.2 p16蛋白表达与临床病理参数的关系分析 依据乳腺癌组织中ER表达情况将181例样本分为ER阳性组和ER阴性组;分别统计两组患者中p16表达情况、年龄、肿块大小、淋巴结转移情况、组织学分级和临床分期等临床资料。
1.3统计学分析 采用SPSS 16.0软件包进行数据处理，计量资料以(x±s)表示，计数资料采用(%)表示，采用？字2检验。乳腺癌组织p16与ER的表达相关性使用四格表？字2检验，ER阳性组和ER阴性组中p16表达与年龄、淋巴结转移数目、组织学分级和临床分期的相关性使用四格表？字2检验，ER阳性组和ER阴性组中p16表达与肿块大小的相关性使用列联表(R×C)？字2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1乳腺癌组织ER和p16蛋白表达检测 乳腺癌组织细胞中ER表达定位于胞核，癌旁组织p16蛋白表达定位于胞核，乳腺癌组织中p16蛋白阳性表达定位于胞浆或胞核。181例乳腺癌标本中，105例为ER表达阳性，76例为ER表达阴性;ER阳性标本中p16蛋白表达率为56.19%(59/105)，ER阴性标本p16蛋白表达率为35.53%(27/76)，ER阴性组p16蛋白表达率低于ER阳性组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
, 百拇医药
2.2乳腺癌组织p16蛋白表达与临床病理参数的关系 105例ER阳性乳腺癌中：p16蛋白表达与患者的年龄、肿块大小、组织学分级、淋巴结(腋窝)转移数及临床分期无关，差异无统计学意义(P均>0.05);在ER阴性乳腺癌中：淋巴结(腋窝)转移数>3组织中p16蛋白表达率为17.24%(5/29)，淋巴结(腋窝)转移数为0～3组织中为46.81%(22/47)，差异有统计学意义(P<0.05);临床Ⅰ+Ⅱ期组织中p16蛋白表达率为44.00%(22/50)，Ⅲ期为19.23%(5/26)，差异有统计学意义(P<0.05);p16蛋白表达与患者的年龄、肿块大小、淋巴结转移数及组织学分级无关，差异无统计学意义(均P>0.05)，见表2。
3讨论
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有57万例乳腺癌患者发生肿瘤细胞的远处转移[7]，部分早期乳腺癌患者，也会发生隐匿性转移[8]。研究根据乳腺癌标志物ER将乳腺癌分为ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌。有研究表明，乳腺癌不同的肿瘤标志物可反映其不同的生物学行为[9]，而且乳腺癌有高度异质性，由于乳腺癌ER表达状态的不同，ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌在发病机制、临床病理特征、治疗反应和预后等方面均有很大差异。
, http://www.100md.com
乳腺癌的发生是一个多因素、多步骤的病理过程，主要涉及癌基因的激活与抑癌基因的失活。抑癌基因p16是细胞周期依赖激酶家族抑制蛋白(CKIs)成员之一，可编码一个由148个氨基酸组成的蛋白质，在限制点(R点)与D型细胞周期蛋白(cyclinD1)竞争性结合CDK4/CDK6，抑制CDK4/CDK6的作用，降低Rb蛋白磷酸化水平，从而阻止细胞通过限制点R点由G1期进入S期。因此，当p16蛋白不能正常表达时，会导致细胞无限增殖，进一步引起肿瘤的发生[10，11]。目前已经证实p16蛋白在乳腺癌中呈低表达状态[3]，但其在ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌中表达是否一致尚不清楚。本实验分别检测181例乳腺癌组织中p16和ER表达情况，并结合临床病理资料进一步分析p16在乳腺癌中的表达与ER的相关性。
国外学者對乳腺癌中12种生长抑制基因的甲基化状态和ER及孕激素受体的关系进行了分析，结果发现p16蛋白表达和ER表达无相关性[12]。Kozomara Z等[13]研究表明，p16蛋白表达和ER表达呈正相关。为了进一步探索p16 蛋白表达与ER的关系，本研究用SP法分别检测了181例乳腺癌组织中ER和p16 蛋白表达情况。结果显示，ER阳性标本中p16蛋白表达率为56.19%(59/105)，ER阴性标本p16蛋白表达率为35.53%(27/76)，ER阴性组p16蛋白表达率低于ER阳性组，差异有统计学意义(P<0.05)。根据以上实验结果可以推测，抑癌基因p16 的表达可能和ER有关，p16蛋白表达的缺失可能主要出现在ER阴性乳腺癌中。, http://www.100md.com(闫战涛)
1.1一般资料 收集常州市第一人民医院2016年5月～2018年6月手术治疗的乳腺癌石蜡标本181例，经病理检测证实全部为浸润性导管癌。患者全部为女性，年龄24～88岁，中位年龄52岁;组织学分级(WHO分标准)级：Ⅰ级30例、Ⅱ级87例、Ⅲ级64例;淋巴结转移：62例淋巴结(腋窝)转移数>3，119例为0～3;临床分期(TNM)：Ⅰ、Ⅱ合并为112例，Ⅲ为69例。所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋。p16抗体(BS1265，Bioworld公司);ER单克隆抗体、SP试剂盒(ZA-0102、SP9000，北京中衫金桥公司)。
1.2方法
1.2.1 ER和p16的检测 使用免疫组织化学染色(SP法)，具体步骤为：将5 μm石蜡切片置于65℃烤箱中，过夜孵育;二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，去离子水冲洗5 min，蒸馏水冲洗2遍;采用pH 6.0的柠檬酸溶液进行抗原修复;加入100 μl稀释好的一抗(1∶200稀释)，室温下孵育1 h，PBS缓冲液冲洗3次;去掉PBS液后，每张切片再加入100 μl稀释好的二抗(1∶300稀释)，在室温下孵育15 min，PBS缓冲液冲洗3次;二氨基联苯胺显色，在显微镜下检验染色质量，最后用中性树胶封片。阴性对照采用PBS缓冲液代替一抗。阳性标准：p16以细胞核和(或)胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数≥10%计为阳性[5]，组织内淋巴细胞或正常的乳腺导管上皮为阳性内对照;ER以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数≥1%计为阳性[6]。
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1.2.2 p16蛋白表达与临床病理参数的关系分析 依据乳腺癌组织中ER表达情况将181例样本分为ER阳性组和ER阴性组;分别统计两组患者中p16表达情况、年龄、肿块大小、淋巴结转移情况、组织学分级和临床分期等临床资料。
1.3统计学分析 采用SPSS 16.0软件包进行数据处理，计量资料以(x±s)表示，计数资料采用(%)表示，采用？字2检验。乳腺癌组织p16与ER的表达相关性使用四格表？字2检验，ER阳性组和ER阴性组中p16表达与年龄、淋巴结转移数目、组织学分级和临床分期的相关性使用四格表？字2检验，ER阳性组和ER阴性组中p16表达与肿块大小的相关性使用列联表(R×C)？字2检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1乳腺癌组织ER和p16蛋白表达检测 乳腺癌组织细胞中ER表达定位于胞核，癌旁组织p16蛋白表达定位于胞核，乳腺癌组织中p16蛋白阳性表达定位于胞浆或胞核。181例乳腺癌标本中，105例为ER表达阳性，76例为ER表达阴性;ER阳性标本中p16蛋白表达率为56.19%(59/105)，ER阴性标本p16蛋白表达率为35.53%(27/76)，ER阴性组p16蛋白表达率低于ER阳性组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
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2.2乳腺癌组织p16蛋白表达与临床病理参数的关系 105例ER阳性乳腺癌中：p16蛋白表达与患者的年龄、肿块大小、组织学分级、淋巴结(腋窝)转移数及临床分期无关，差异无统计学意义(P均>0.05);在ER阴性乳腺癌中：淋巴结(腋窝)转移数>3组织中p16蛋白表达率为17.24%(5/29)，淋巴结(腋窝)转移数为0～3组织中为46.81%(22/47)，差异有统计学意义(P<0.05);临床Ⅰ+Ⅱ期组织中p16蛋白表达率为44.00%(22/50)，Ⅲ期为19.23%(5/26)，差异有统计学意义(P<0.05);p16蛋白表达与患者的年龄、肿块大小、淋巴结转移数及组织学分级无关，差异无统计学意义(均P>0.05)，见表2。
3讨论
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有57万例乳腺癌患者发生肿瘤细胞的远处转移[7]，部分早期乳腺癌患者，也会发生隐匿性转移[8]。研究根据乳腺癌标志物ER将乳腺癌分为ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌。有研究表明，乳腺癌不同的肿瘤标志物可反映其不同的生物学行为[9]，而且乳腺癌有高度异质性，由于乳腺癌ER表达状态的不同，ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌在发病机制、临床病理特征、治疗反应和预后等方面均有很大差异。
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乳腺癌的发生是一个多因素、多步骤的病理过程，主要涉及癌基因的激活与抑癌基因的失活。抑癌基因p16是细胞周期依赖激酶家族抑制蛋白(CKIs)成员之一，可编码一个由148个氨基酸组成的蛋白质，在限制点(R点)与D型细胞周期蛋白(cyclinD1)竞争性结合CDK4/CDK6，抑制CDK4/CDK6的作用，降低Rb蛋白磷酸化水平，从而阻止细胞通过限制点R点由G1期进入S期。因此，当p16蛋白不能正常表达时，会导致细胞无限增殖，进一步引起肿瘤的发生[10，11]。目前已经证实p16蛋白在乳腺癌中呈低表达状态[3]，但其在ER阳性乳腺癌和ER阴性乳腺癌中表达是否一致尚不清楚。本实验分别检测181例乳腺癌组织中p16和ER表达情况，并结合临床病理资料进一步分析p16在乳腺癌中的表达与ER的相关性。
国外学者對乳腺癌中12种生长抑制基因的甲基化状态和ER及孕激素受体的关系进行了分析，结果发现p16蛋白表达和ER表达无相关性[12]。Kozomara Z等[13]研究表明，p16蛋白表达和ER表达呈正相关。为了进一步探索p16 蛋白表达与ER的关系，本研究用SP法分别检测了181例乳腺癌组织中ER和p16 蛋白表达情况。结果显示，ER阳性标本中p16蛋白表达率为56.19%(59/105)，ER阴性标本p16蛋白表达率为35.53%(27/76)，ER阴性组p16蛋白表达率低于ER阳性组，差异有统计学意义(P<0.05)。根据以上实验结果可以推测，抑癌基因p16 的表达可能和ER有关，p16蛋白表达的缺失可能主要出现在ER阴性乳腺癌中。, http://www.100md.com(闫战涛)