Lv—shRNA—Hsa—microRNA—691慢病毒表达载体的构建与鉴定
【摘要】目的：构建 Lv-shRNA-hsa-microRNA-691慢病毒表达载体。
方法： 双酶切及测序鉴定正确后进行慢病毒包装与滴度检测。构建成功后感染人胰腺癌细胞Panc-1， 48h后Real-time Q-PCR检测miR-691的表达。
结果：病毒感染后的Panc-1胰腺癌细胞在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光，Real-time Q-PCR显示被感染细胞的miR-691表达量较未感染细胞显著增高。
结论：建立了高效稳定表达Lv-shRNA-hsa-miR-691 的慢病毒转染系统。
【关键词】microRNA； Lv-shRNA-hsa- miR-691； 慢病毒表达载体
microRNA是近年来在人体中发现一类长度约为22个核苷酸左右的非编码RNA，它不直接参与蛋白质的合成，通过对人体1/3左右的mRNA进行调节，控制着细胞分化、增殖和凋亡等生命活动，并能够特异性靶向mRNA实现对其转录后抑制[1]。已有的研究表明：波形蛋白作为胰腺癌上皮-间质化标志蛋白之一，与胰腺癌的侵袭转移密切相关[2， 3]。通过生物性息学预测Lv-shRNA-hsa-miR-691可靶向调控波形蛋白的表达。本研究旨在构建针对Lv-shRNA-hsa-miR-691高效的慢病毒表达系统，为深入研究其靶向调控波形蛋白的表达对胰腺肿瘤细胞侵袭转移提供一种研究工具。
1.材料和方法
1.1 材料
1. 质粒、菌株和细胞及主要酶和试剂
慢病毒质粒pLenti-CMV-GFP Puro (658-5)、包装质粒pCMVDR8.74 和 pMD2.G购自Addgene公司；大肠杆菌菌株PANC-1细胞妥善保存。限制性内切酶AgeI、EcoR I、T4 连接酶购自Takara公司；； 总RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；Fugene HD转染试剂购自Roche公司；Lv-shRNA-hsa-miR-691定量PCR引物及miRNA qRT-PCR 检测试剂盒购自GeneCopoeia公司。
1.2 方法
慢病毒制备 滴度测定及在胰腺癌细胞中的表达
将DNA混合物加至100μl Fugene HD转染试剂中，加入培养瓶，转染24h后，加入 20ml Virus Production培养基，转染44-48h，收集上清液到离心管内。将收集的上清液4℃，1000 rpm/min，离心5min，取上清超速离心，风干；后每管加入30ml 病毒上清，然后将2ml的20%蔗糖溶液(PBS配制)加入上清液的底部，平衡后4℃，25000 rpm/min，离心2h。离心完毕后弃去上清液，管底白色沉淀晾干后加入100u l冷PBS重悬，轻轻吹打溶解后收集病毒，分装5μl/管，-80℃冻存。
胰腺癌细胞PANC-1接种。待细胞覆盖至70%左右时，取其中3孔，以感染复数(MOI=4：1)比例加入LV-plenti-GFP-miR-691感染胰腺癌细胞PANC-1，观察绿色荧光蛋白表达情况。
1.3 统计学处理：
采用t检测，由SPSS 17.0统计软件分析结果。检测水准为P(双侧)<0.05。
2 结果：
LV-plenti-GFP-miR-691感染PANC-1细胞，GFP表达绿色荧光呈高峰。Real-time Q-PCR检测Lv-shRNA-hsa-miR-691在PANC-1细胞中表达结果，其表达量结果显示LV-plenti-GFP-miR-691病毒感染较对照组的miR-691表达显著升高200多倍。
3 讨论
miR-691主要存在于胎肝、中枢神经、空肠、甲状腺在大多数成熟的器官和组织包括胰腺不表达[5]。研究表明miR-691在多种肿瘤中表达失调，其可能参与了多种恶性肿瘤的发生发展。最近研究表明：miR-691能抑制头颈部鳞癌的侵袭转移，促进癌细胞凋亡[6]；miR-691在胰腺癌中的表达情况及其作用亦未见研究报道。
本研究成功构建Lv-shRNA-hsa-miR-691 慢病毒表达系统，经双酶切测序分析，与Sanger miRBase中的序列一致，没有碱基缺失或替换；包装成慢病毒感染胰腺癌细胞PANC-1后能稳定高效地表达成熟Lv-shRNA-hsa-miR-691，为深入研究Lv-shRNA-hsa-miR-691的生物学功能和作用机制提供强有力的工具。
【References】
[1]Bartel DP. MicroRNAs： genomics， biogenesis， mechanism， and function. Cell. 2004. 116(2)： 281-97.
[2]Vasko V， Espinosa AV， Scouten W， et al. Gene expression and functional evidence of epithelial-to-mesenchymal transition in papillary thyroid carcinoma invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007. 104(8)： 2803-8.
[3]慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞VIM基因的表达(英文). Chinese-German Journal of Clinical Oncology. 2009. (03)： 145-149.
[4]Liang Y， Ridzon D， Wong L， Chen C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 2007. 8： 166.
[5]Liu X， Chen Z， Yu J， Xia J， Zhou X. MicroRNA profiling and head and neck cancer. Comp Funct Genomics. 2009 ： 837514.
[6]Cockrell AS， Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 2007. 36(3)： 184-204., http://www.100md.com(何燕浙 唐德军)
方法： 双酶切及测序鉴定正确后进行慢病毒包装与滴度检测。构建成功后感染人胰腺癌细胞Panc-1， 48h后Real-time Q-PCR检测miR-691的表达。
结果：病毒感染后的Panc-1胰腺癌细胞在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光，Real-time Q-PCR显示被感染细胞的miR-691表达量较未感染细胞显著增高。
结论：建立了高效稳定表达Lv-shRNA-hsa-miR-691 的慢病毒转染系统。
【关键词】microRNA； Lv-shRNA-hsa- miR-691； 慢病毒表达载体
microRNA是近年来在人体中发现一类长度约为22个核苷酸左右的非编码RNA，它不直接参与蛋白质的合成，通过对人体1/3左右的mRNA进行调节，控制着细胞分化、增殖和凋亡等生命活动，并能够特异性靶向mRNA实现对其转录后抑制[1]。已有的研究表明：波形蛋白作为胰腺癌上皮-间质化标志蛋白之一，与胰腺癌的侵袭转移密切相关[2， 3]。通过生物性息学预测Lv-shRNA-hsa-miR-691可靶向调控波形蛋白的表达。本研究旨在构建针对Lv-shRNA-hsa-miR-691高效的慢病毒表达系统，为深入研究其靶向调控波形蛋白的表达对胰腺肿瘤细胞侵袭转移提供一种研究工具。
1.材料和方法
1.1 材料
1. 质粒、菌株和细胞及主要酶和试剂
慢病毒质粒pLenti-CMV-GFP Puro (658-5)、包装质粒pCMVDR8.74 和 pMD2.G购自Addgene公司；大肠杆菌菌株PANC-1细胞妥善保存。限制性内切酶AgeI、EcoR I、T4 连接酶购自Takara公司；； 总RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；Fugene HD转染试剂购自Roche公司；Lv-shRNA-hsa-miR-691定量PCR引物及miRNA qRT-PCR 检测试剂盒购自GeneCopoeia公司。
1.2 方法
慢病毒制备 滴度测定及在胰腺癌细胞中的表达
将DNA混合物加至100μl Fugene HD转染试剂中，加入培养瓶，转染24h后，加入 20ml Virus Production培养基，转染44-48h，收集上清液到离心管内。将收集的上清液4℃，1000 rpm/min，离心5min，取上清超速离心，风干；后每管加入30ml 病毒上清，然后将2ml的20%蔗糖溶液(PBS配制)加入上清液的底部，平衡后4℃，25000 rpm/min，离心2h。离心完毕后弃去上清液，管底白色沉淀晾干后加入100u l冷PBS重悬，轻轻吹打溶解后收集病毒，分装5μl/管，-80℃冻存。
胰腺癌细胞PANC-1接种。待细胞覆盖至70%左右时，取其中3孔，以感染复数(MOI=4：1)比例加入LV-plenti-GFP-miR-691感染胰腺癌细胞PANC-1，观察绿色荧光蛋白表达情况。
1.3 统计学处理：
采用t检测，由SPSS 17.0统计软件分析结果。检测水准为P(双侧)<0.05。
2 结果：
LV-plenti-GFP-miR-691感染PANC-1细胞，GFP表达绿色荧光呈高峰。Real-time Q-PCR检测Lv-shRNA-hsa-miR-691在PANC-1细胞中表达结果，其表达量结果显示LV-plenti-GFP-miR-691病毒感染较对照组的miR-691表达显著升高200多倍。
3 讨论
miR-691主要存在于胎肝、中枢神经、空肠、甲状腺在大多数成熟的器官和组织包括胰腺不表达[5]。研究表明miR-691在多种肿瘤中表达失调，其可能参与了多种恶性肿瘤的发生发展。最近研究表明：miR-691能抑制头颈部鳞癌的侵袭转移，促进癌细胞凋亡[6]；miR-691在胰腺癌中的表达情况及其作用亦未见研究报道。
本研究成功构建Lv-shRNA-hsa-miR-691 慢病毒表达系统，经双酶切测序分析，与Sanger miRBase中的序列一致，没有碱基缺失或替换；包装成慢病毒感染胰腺癌细胞PANC-1后能稳定高效地表达成熟Lv-shRNA-hsa-miR-691，为深入研究Lv-shRNA-hsa-miR-691的生物学功能和作用机制提供强有力的工具。
【References】
[1]Bartel DP. MicroRNAs： genomics， biogenesis， mechanism， and function. Cell. 2004. 116(2)： 281-97.
[2]Vasko V， Espinosa AV， Scouten W， et al. Gene expression and functional evidence of epithelial-to-mesenchymal transition in papillary thyroid carcinoma invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007. 104(8)： 2803-8.
[3]慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞VIM基因的表达(英文). Chinese-German Journal of Clinical Oncology. 2009. (03)： 145-149.
[4]Liang Y， Ridzon D， Wong L， Chen C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 2007. 8： 166.
[5]Liu X， Chen Z， Yu J， Xia J， Zhou X. MicroRNA profiling and head and neck cancer. Comp Funct Genomics. 2009 ： 837514.
[6]Cockrell AS， Kafri T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 2007. 36(3)： 184-204., http://www.100md.com(何燕浙 唐德军)