乙肝抗-HBc和抗-HBe在ELISA法出现假阳性原因分析
【摘要】 目的：探讨酶联免疫吸附试验(ELISA)检测乙肝病毒血清抗-HBc与抗-HBe出现假阳性的影响因素，旨在提高乙肝检验结果的准确性。方法：对采用酶联免疫吸附试验检测出的血清阳性标本抗-HBc112例、抗-HBe118例，用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)方法进行复检，统计假阳性率，并分析出现假阳性的因素。结果：采用ELISA法检测出的血清阳性标本抗-HBc112例、抗-HBe118例，以TRFIA方法为基准复检后假阳性分别为11例、13例，ELISA法检测乙肝病毒抗-HBc假阳性率为9.82%(11/112)、抗-HBe假阳性率为11.02%(13/118)。结论：ELISA法检测乙肝抗-HBe和抗-HBc存在一定比例的假阳性率，除了ELISA方法学和试剂盒本身影响因素外，标本处理不好、实验操作不当也是导致其出现假阳性的主要原因。检验人员应严格操作，降低假阳性率；对于疑为假阳性的标本，应进一步用多种方法复检，以保证检验结果的准确性。
【关键词】 乙肝；抗-HBc；抗-HBe；酶联免疫吸附试验(ELISA)；时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)；假阳性；假阳性率。
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尽管目前乙肝病毒(HBV)感染的血清标志物检测方法较多，但在临床上应用最多的还是酶联免疫吸附试验(ELISA)[1]。ELISA方法操作简便、结果可靠，但是也存在一些问题，特别是乙肝5项检测中的e抗体(抗-HBe)、核心抗体(抗-HBc)易出现假阳性[2~3]，影响了检测结果的准确性。本文采用两种方法对112例抗-HBc阳性、118例抗-HBe阳性血清标本进行了对比性检测，旨在探讨ELISA检测乙肝病毒血清抗-HBe与抗-HBc出现假阳性的影响因素，提高乙肝检验结果的准确性。
1 材料与方法
1.1 标本来源 本组用ELISA法检测出的112例抗-HBc阳性、118例抗-HBe阳性血清标本来自新乡市传染病医院2010年6月~2012年1月923例门诊和住院的肝病病人，其中男 512例，女411例；年龄17～80岁，平均45.5±7.5岁。
1.2 方法
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1.2.1 仪器与试剂 ELISA法使用的仪器为北京普朗新技术公司酶免仪以及配套洗板机，测定试剂由上海科华和山东3v生物工程股份有限公司提供，通过卫生部批检，并贴有防伪标签。时间分辨荧光免疫分析方法(TRFIA)检测使用上海新波生物技术有限公司生产的EFFICUTA全自动标本前处理系统及ANYTEST时间分辨荧光检测仪，测定试剂由上海新波生物技术有限公司提供，通过卫生部批检，并贴有防伪标签。
1.2.2 检测方法 抽取病人空腹静脉血3~5mL，入干燥试管或者促凝分离胶密封试管内，37℃放置待凝固后，离心分离血清后1~2h内检测。先用ELISA法(上海科华试剂盒)检测，检测前严格按照说明书将试剂盒在室温下平衡30min，对血清标本同时检测乙肝5项指标，将检测出的抗-HBe、抗-HBc阳性的标本，再次用山东3v试剂盒复检，最后将2次检测均为阳性的血清标本，用TRFIA方法(上海新波配套仪器及试剂)进行复查，以TRFIA方法为基准复检后排除的阳性为假阳性。
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1.2.3 判断标准 ELISA法与TRFIA法均严格按说明书由固定主管检验技师操作。ELISA法阳性结果判定：按酶标仪结果判读阴阳性，抗-HBc、抗-HBe以抑制率>50%判阳性，对弱阳性结果均须2孔复查，仍为阳性者判为阳性。TRFIA法阳性结果判定：超过下述参考范围上限，判为阳性，否则为阴性，TRFIA法检测结果参考范围：抗-HBe 0-0.2PEIU/mL、抗-HBc、0-0.9PEIU/mL。
1.2.4 质控 所用检测试剂均通过卫生部批检，试剂和质控血清均在有效期内使用。全部仪器、设备运行状况良好，每日质控结果、每批测定阴阳对照均在可信范围，乙肝5项每次参加河南省临检中心质控均合格。
2 结果
923例肝病病人的血清标本用ELISA法检测出抗-HBc阳性112例、抗-HBe阳性118例，以TRFIA方法为基准复检后抗-HBc阳性101例、抗-HBe阳性105例，假阳性分别为11例、13例， ELISA法检测乙肝病毒抗-HBc假阳性率为9.82%(11/112)、抗-HBe假阳性率为11.02%(13/118)。
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3 讨论
酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测乙肝病毒抗-HBe、抗-HBc采用竞争法，标记或结合物分别是抗-HBe和抗-HBc[4]，检测结果以不显色为阳性，较采用夹心法的其他3项更易出现假阳性[5]，国内文献认为[6~7]标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全、试剂盒的抗原和酶结合物纯度低、操作不当都是ELISA法假阳性出现的主要因素。笔者为了克服ELISA法试剂盒本身质量，采用两个不同厂家试剂盒进行检测，但是ELISA法抗-HBe、抗-HBc假阳性跟其本身没有时间分辨荧光免疫分析法敏感和高稳定性也有一定的关系[8]，时间分辨荧光免疫分析法(Time - Resolved Fluorescence，TRFIA)是继放免、酶标、化学发光、电化学发光后成为一种更新、更灵敏的检测方法，因其标记物(稀土离子)的独一无二的物理性质及化学性质，具备了高稳定性、干扰因素少等优点，本文选取TRFIA方法为基准，以此来鉴定ELISA法抗-HBe、抗-HBc假阳性理论依据也在于此。
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除了方法学和试剂盒本身影响因素外，结合我们的工作经验和参考同行的报道，笔者认为，首先要重视标本的处理，建议尽量采用肝素的密封试管或者促凝分离胶密封试管，防止纤维蛋白原的干扰，对于重度脂血、溶血标本建议重新抽血，离心分离血清非常重要，不要为了争取时间快速检测，在血液还未开始凝固即强行离心分离血清，因为此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果。另外在操作中尽量使血清和酶结合物同步加入，因为ELISA法检测抗-HBe、抗-HBc采用的是HBeAg和HBcAg包被反应板，加入待检标本和酶标记的单克隆抗-HBe、抗-HBc，竞争结合HBeAg和HBcAg，如果酶标抗体的加入滞后于待检标本，很容易出现非特异性吸附，导致假阳性[9]。做好洗板工作也是克服ELISA法出现假阳性重要保障，仪器洗板应重视检查洗液是否按照要求配置、洗液量是否充足，洗液针是否通畅等，手工洗板应保证洗板次数、洗板质量(每次洗板间隔时间、有无气泡等)，此外温育时反应孔要贴封片或加盖，避免标本或稀释液蒸发吸附于孔壁，影响洗涤效果。
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综上所述，ELISA法检测乙肝抗-HBe和抗-HBc会存在一定比例的假阳性率，笔者抗-HBc假阳性率为9.82%(11/112)、抗-HBe假阳性率为11.02%(13/118)略低于国内同行的报道[2，3，5]。除了ELISA方法学和试剂盒本身影响因素外，标本处理不好、实验操作不当也是导致其出现假阳性率的主要原因，检验人员除了严格操作、降低假阳性率外，对于疑为假阳性的标本，应进一步用多种方法复检，以保证检验结果的准确性。
参考文献
[1] 林云，吕长坤，张乐之，等.用中和试验评价四种ELISA试剂盒检测抗-HBe结果的准确性[J].检验医学，2010，25(06)：435-437.
[2] 李艳霞.ELISA法检测乙肝病毒抗-HBc和抗-HBe假阳性原因分析[J].中国当代医药，2010，17(36)：82-84.
, http://www.100md.com [3] 兰忠诚.ELISA法检测血清HBV抗-HBc假阳性的原因探讨[J].中国现代药物应用，2009，3(8)：105-105.
[4] 张卓然.临床微生物学和微生物检验[M].3版.北京：人民卫生出版社，2004，379.
[5] 文家远，酶联免疫吸附试验检测抗-HBe与抗-HBc假阳性分析[J].医学信息，2009，22(8)：1602-1603.
[6] 黄道连.ELISA法检测乙型肝炎两对半影响因素分析与对策[J].检验医学与临床，2007，08：101-103.
[7] 吴淑梅，林云，王辉，等.竞争抑制法检测抗-HBc总抗体的影响因素及对策[J].检验医学，2006，21(4)：376-379.
[8] 罗开忠，杨旭，苏先狮，等.时间分辨免疫荧光法检测乙型肝炎病毒标志物[J].中华肝脏病杂志，2003，11(9)：569.
[9] 黄作美，黄光华，陈江萍. ELISA一步法检测乙型肝炎抗-HBc、抗-HBe存在假阳性[J].上海医学，1997，20(2)：100-103., 百拇医药(赵治凤 贾秋龙)
【关键词】 乙肝；抗-HBc；抗-HBe；酶联免疫吸附试验(ELISA)；时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)；假阳性；假阳性率。
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尽管目前乙肝病毒(HBV)感染的血清标志物检测方法较多，但在临床上应用最多的还是酶联免疫吸附试验(ELISA)[1]。ELISA方法操作简便、结果可靠，但是也存在一些问题，特别是乙肝5项检测中的e抗体(抗-HBe)、核心抗体(抗-HBc)易出现假阳性[2~3]，影响了检测结果的准确性。本文采用两种方法对112例抗-HBc阳性、118例抗-HBe阳性血清标本进行了对比性检测，旨在探讨ELISA检测乙肝病毒血清抗-HBe与抗-HBc出现假阳性的影响因素，提高乙肝检验结果的准确性。
1 材料与方法
1.1 标本来源 本组用ELISA法检测出的112例抗-HBc阳性、118例抗-HBe阳性血清标本来自新乡市传染病医院2010年6月~2012年1月923例门诊和住院的肝病病人，其中男 512例，女411例；年龄17～80岁，平均45.5±7.5岁。
1.2 方法
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1.2.2 检测方法 抽取病人空腹静脉血3~5mL，入干燥试管或者促凝分离胶密封试管内，37℃放置待凝固后，离心分离血清后1~2h内检测。先用ELISA法(上海科华试剂盒)检测，检测前严格按照说明书将试剂盒在室温下平衡30min，对血清标本同时检测乙肝5项指标，将检测出的抗-HBe、抗-HBc阳性的标本，再次用山东3v试剂盒复检，最后将2次检测均为阳性的血清标本，用TRFIA方法(上海新波配套仪器及试剂)进行复查，以TRFIA方法为基准复检后排除的阳性为假阳性。
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1.2.3 判断标准 ELISA法与TRFIA法均严格按说明书由固定主管检验技师操作。ELISA法阳性结果判定：按酶标仪结果判读阴阳性，抗-HBc、抗-HBe以抑制率>50%判阳性，对弱阳性结果均须2孔复查，仍为阳性者判为阳性。TRFIA法阳性结果判定：超过下述参考范围上限，判为阳性，否则为阴性，TRFIA法检测结果参考范围：抗-HBe 0-0.2PEIU/mL、抗-HBc、0-0.9PEIU/mL。
1.2.4 质控 所用检测试剂均通过卫生部批检，试剂和质控血清均在有效期内使用。全部仪器、设备运行状况良好，每日质控结果、每批测定阴阳对照均在可信范围，乙肝5项每次参加河南省临检中心质控均合格。
2 结果
923例肝病病人的血清标本用ELISA法检测出抗-HBc阳性112例、抗-HBe阳性118例，以TRFIA方法为基准复检后抗-HBc阳性101例、抗-HBe阳性105例，假阳性分别为11例、13例， ELISA法检测乙肝病毒抗-HBc假阳性率为9.82%(11/112)、抗-HBe假阳性率为11.02%(13/118)。
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3 讨论
酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测乙肝病毒抗-HBe、抗-HBc采用竞争法，标记或结合物分别是抗-HBe和抗-HBc[4]，检测结果以不显色为阳性，较采用夹心法的其他3项更易出现假阳性[5]，国内文献认为[6~7]标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全、试剂盒的抗原和酶结合物纯度低、操作不当都是ELISA法假阳性出现的主要因素。笔者为了克服ELISA法试剂盒本身质量，采用两个不同厂家试剂盒进行检测，但是ELISA法抗-HBe、抗-HBc假阳性跟其本身没有时间分辨荧光免疫分析法敏感和高稳定性也有一定的关系[8]，时间分辨荧光免疫分析法(Time - Resolved Fluorescence，TRFIA)是继放免、酶标、化学发光、电化学发光后成为一种更新、更灵敏的检测方法，因其标记物(稀土离子)的独一无二的物理性质及化学性质，具备了高稳定性、干扰因素少等优点，本文选取TRFIA方法为基准，以此来鉴定ELISA法抗-HBe、抗-HBc假阳性理论依据也在于此。
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除了方法学和试剂盒本身影响因素外，结合我们的工作经验和参考同行的报道，笔者认为，首先要重视标本的处理，建议尽量采用肝素的密封试管或者促凝分离胶密封试管，防止纤维蛋白原的干扰，对于重度脂血、溶血标本建议重新抽血，离心分离血清非常重要，不要为了争取时间快速检测，在血液还未开始凝固即强行离心分离血清，因为此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果。另外在操作中尽量使血清和酶结合物同步加入，因为ELISA法检测抗-HBe、抗-HBc采用的是HBeAg和HBcAg包被反应板，加入待检标本和酶标记的单克隆抗-HBe、抗-HBc，竞争结合HBeAg和HBcAg，如果酶标抗体的加入滞后于待检标本，很容易出现非特异性吸附，导致假阳性[9]。做好洗板工作也是克服ELISA法出现假阳性重要保障，仪器洗板应重视检查洗液是否按照要求配置、洗液量是否充足，洗液针是否通畅等，手工洗板应保证洗板次数、洗板质量(每次洗板间隔时间、有无气泡等)，此外温育时反应孔要贴封片或加盖，避免标本或稀释液蒸发吸附于孔壁，影响洗涤效果。
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综上所述，ELISA法检测乙肝抗-HBe和抗-HBc会存在一定比例的假阳性率，笔者抗-HBc假阳性率为9.82%(11/112)、抗-HBe假阳性率为11.02%(13/118)略低于国内同行的报道[2，3，5]。除了ELISA方法学和试剂盒本身影响因素外，标本处理不好、实验操作不当也是导致其出现假阳性率的主要原因，检验人员除了严格操作、降低假阳性率外，对于疑为假阳性的标本，应进一步用多种方法复检，以保证检验结果的准确性。
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