人子宫内膜异位症在位间质细胞的离体培养(1)
【摘要】 目的：通过对子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)患者在位内膜间质细胞进行体外分离、纯化与鉴定，为进一步探讨子宫内膜异位症发生、发展的分子生物学机制提供一个理想的实验模型。方法：胰蛋白酶、胶原酶消化在位内膜组织， 离心、筛网法进行分离纯化间质细胞， 胰蛋白酶-EDTA联合消化法传代培养， 光镜、免疫细胞化学染色进行细胞鉴定。结果：采用胰蛋白酶、胶原酶消化结合筛网过滤及离心分离法，在位内膜间质细胞的分离培养成活率为83.33%，纯度达90%以上。结论：该方法简便易行， 可获得符合实验要求的人子宫内膜异位症间质细胞，可以用于子宫内膜异位症发病机制、药物筛选等研究。
【关键词】 子宫内膜异位症；子宫内膜；间质细胞；细胞培养
子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是指具有生长功能的子宫内膜组织(腺体和间质)在子宫腔被覆内膜及宫体肌层以外的其它部位，常引起患者痛经、慢性盆腔疼痛、不孕等，严重影响患病妇女的生活质量。它是一种发病机制不清的良性疾病，但具有恶性肿瘤种植、远处种植生长及复发率高的生物学行为，而成为研究热点。本研究的目的是分离和培养子宫内膜异位症患者的在位内膜间质细胞，为进一步探讨EMs的发病机制和治疗药物筛选提供一个有价值的实验模型。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 组织标本的获取 选择2007年8月～2011年11月在中南大学湘雅二医院、河南省人民医院妇产科因子宫内膜异位症行手术并经病理确诊的病例60例，年龄21～46岁，平均(31.20±6.13)岁；月经周期规则(23～35天)，无其它妇科疾病史及内分泌、免疫和代谢性疾病，术前6个月内未接受激素治疗。在位子宫内膜60例通过EMs患者切下的子宫标本或刮宫术取得，留取分两部分，一部分投入有预冷的PBS缓冲液的培养瓶中，尽快送实验室作细胞培养用；另一部分放入10%福尔马林中固定，作HE染色及子宫内膜分期，其中增生期36例，分泌期24例。
1.2 主要的试剂 DMEM/F-12(FD)培养基(美国GIBCO公司)，新生牛血清(NBS)(美国GIBCO公司)，Ⅳ型胶原酶(美国Invitrogen公司)，硫酸链霉素(深圳华药南方制药有限公司)，青霉素钠(华北制药股份有限公司)，鼠抗人波形蛋白抗体(武汉博士德)，鼠抗人角蛋白抗体(武汉博士德)，兔抗人催乳素抗体(武汉博士德)，SABC试剂盒(武汉博士德)，DAB显色试剂盒(北京中杉)。
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1.3 方法
1.3.1 子宫内膜间质细胞的培养方法 参照Morimoto [1]、苑春莉[2]等的方法改进，将组织在无菌操作下用PBS液冲洗，剪成0.5～1mm3大小，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃温箱中消化30min后，倾去胰酶，加入1mg/ml的Ⅳ型胶原酶，37℃恒温摇床中消化1～6h，吹打消化液，经200目不锈钢滤网过滤，将滤液移入离心管中经800rpm离心5min，弃上清，加入培养液吹打成细胞悬液后以104/ml的密度接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2的温箱中培养。
1.3.2 传代培养 倒置显微镜观察细胞，2～3d更换一次培养液，当细胞铺至培养瓶的80%时传代，用PBS漂洗细胞，含0.02%EDTA-0.1%胰蛋白酶1ml冲洗，再加入1ml，37℃，1～2min，大部分细胞接近变圆形，欲与培养瓶脱离时加入培养液终止消化，吹打细胞呈单细胞悬液，将其移入离心管中800rpm离心3min，弃上清，加入PBS1ml冲洗，再加入培养液吹打成细胞悬液，进行细胞计数，加入培养液分瓶以104的密度接种，置37℃、5%CO2的温箱中培养。
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1.3.3 子宫内膜间质细胞的鉴定 角蛋白广泛存在于人类的上皮组织及培养的上皮细胞内，而波形蛋白则主要位于间质细胞中[ 3，4 ]。由于非孕子宫内膜催乳素仅仅由子宫内膜间质细胞产生，腺体和成纤维细胞不产生PRL[5，6，7]，分泌晚期子宫内膜能自发产生PRL ，在增殖期子宫内膜间质细胞与加醋酸甲地孕酮培养5～6d后PRL分泌升高，可以进行子宫内膜来源间质细胞的鉴定。为了对细胞进行鉴定，分别用鼠抗人角蛋白和波形蛋白单克隆抗体及兔抗人PRL多克隆抗体作SP免疫细胞化学染色，再用苏木素复染，凡细胞质染成棕黄色为角蛋白、波形蛋白或PRL阳性细胞，未显棕黄色为阴性细胞，每次染色取子宫内膜作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。
2 结果
2.1 在位内膜间质细胞分离培养情况 我们对60例在位内膜，结果50例培养成功，余因细菌污染失败，培养成功率为83.33%。
2.2 在位内膜间质细胞形态及生长情况 倒置显微镜下观察，在位内膜间质细胞24h后基本能贴壁，体积较大，呈多边形或梭形，培养初期呈极性生长，培养3～4d后细胞排列无极性，平铺生长，外观呈伸展、挺直状，类似成纤维细胞，也有中间宽两头尖纺锤形状的细胞，细胞质薄而透明，核居中，呈圆形或椭圆形，平均可维持生长5～8周，传代4～6次，随着传代次数的增加，细胞伸长呈梭形，具有成纤维细胞形态(图2-1)。
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2.3 免疫细胞化学染色鉴定 培养细胞中角蛋白染色阴性，波形蛋白、催乳素染色阳性者占90%以上(图2-2，2-3，2-4)，表明培养的细胞纯度达到90%以上。
图2-1子宫内膜间质细胞形态
Fig2-1: Cytomorphological examination of eutopic endometrial primary stromal cells(Light microscope，×200) Eutopic stromal cell of endometriosis
图2-2：免疫组化检测波形蛋白的表达
Fig2-2:Immunohistochemical expression of vimentin(S-P，×100) The positive expression of vimentin in eutopic stromal cell, 百拇医药(王焕萍 黄凤英 刘秋红 邹颖)
【关键词】 子宫内膜异位症；子宫内膜；间质细胞；细胞培养
子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是指具有生长功能的子宫内膜组织(腺体和间质)在子宫腔被覆内膜及宫体肌层以外的其它部位，常引起患者痛经、慢性盆腔疼痛、不孕等，严重影响患病妇女的生活质量。它是一种发病机制不清的良性疾病，但具有恶性肿瘤种植、远处种植生长及复发率高的生物学行为，而成为研究热点。本研究的目的是分离和培养子宫内膜异位症患者的在位内膜间质细胞，为进一步探讨EMs的发病机制和治疗药物筛选提供一个有价值的实验模型。
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1 材料与方法
1.1 组织标本的获取 选择2007年8月～2011年11月在中南大学湘雅二医院、河南省人民医院妇产科因子宫内膜异位症行手术并经病理确诊的病例60例，年龄21～46岁，平均(31.20±6.13)岁；月经周期规则(23～35天)，无其它妇科疾病史及内分泌、免疫和代谢性疾病，术前6个月内未接受激素治疗。在位子宫内膜60例通过EMs患者切下的子宫标本或刮宫术取得，留取分两部分，一部分投入有预冷的PBS缓冲液的培养瓶中，尽快送实验室作细胞培养用；另一部分放入10%福尔马林中固定，作HE染色及子宫内膜分期，其中增生期36例，分泌期24例。
1.2 主要的试剂 DMEM/F-12(FD)培养基(美国GIBCO公司)，新生牛血清(NBS)(美国GIBCO公司)，Ⅳ型胶原酶(美国Invitrogen公司)，硫酸链霉素(深圳华药南方制药有限公司)，青霉素钠(华北制药股份有限公司)，鼠抗人波形蛋白抗体(武汉博士德)，鼠抗人角蛋白抗体(武汉博士德)，兔抗人催乳素抗体(武汉博士德)，SABC试剂盒(武汉博士德)，DAB显色试剂盒(北京中杉)。
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1.3 方法
1.3.1 子宫内膜间质细胞的培养方法 参照Morimoto [1]、苑春莉[2]等的方法改进，将组织在无菌操作下用PBS液冲洗，剪成0.5～1mm3大小，加入0.25%的胰蛋白酶，37℃温箱中消化30min后，倾去胰酶，加入1mg/ml的Ⅳ型胶原酶，37℃恒温摇床中消化1～6h，吹打消化液，经200目不锈钢滤网过滤，将滤液移入离心管中经800rpm离心5min，弃上清，加入培养液吹打成细胞悬液后以104/ml的密度接种于培养瓶中，置37℃、5%CO2的温箱中培养。
1.3.2 传代培养 倒置显微镜观察细胞，2～3d更换一次培养液，当细胞铺至培养瓶的80%时传代，用PBS漂洗细胞，含0.02%EDTA-0.1%胰蛋白酶1ml冲洗，再加入1ml，37℃，1～2min，大部分细胞接近变圆形，欲与培养瓶脱离时加入培养液终止消化，吹打细胞呈单细胞悬液，将其移入离心管中800rpm离心3min，弃上清，加入PBS1ml冲洗，再加入培养液吹打成细胞悬液，进行细胞计数，加入培养液分瓶以104的密度接种，置37℃、5%CO2的温箱中培养。
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1.3.3 子宫内膜间质细胞的鉴定 角蛋白广泛存在于人类的上皮组织及培养的上皮细胞内，而波形蛋白则主要位于间质细胞中[ 3，4 ]。由于非孕子宫内膜催乳素仅仅由子宫内膜间质细胞产生，腺体和成纤维细胞不产生PRL[5，6，7]，分泌晚期子宫内膜能自发产生PRL ，在增殖期子宫内膜间质细胞与加醋酸甲地孕酮培养5～6d后PRL分泌升高，可以进行子宫内膜来源间质细胞的鉴定。为了对细胞进行鉴定，分别用鼠抗人角蛋白和波形蛋白单克隆抗体及兔抗人PRL多克隆抗体作SP免疫细胞化学染色，再用苏木素复染，凡细胞质染成棕黄色为角蛋白、波形蛋白或PRL阳性细胞，未显棕黄色为阴性细胞，每次染色取子宫内膜作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。
2 结果
2.1 在位内膜间质细胞分离培养情况 我们对60例在位内膜，结果50例培养成功，余因细菌污染失败，培养成功率为83.33%。
2.2 在位内膜间质细胞形态及生长情况 倒置显微镜下观察，在位内膜间质细胞24h后基本能贴壁，体积较大，呈多边形或梭形，培养初期呈极性生长，培养3～4d后细胞排列无极性，平铺生长，外观呈伸展、挺直状，类似成纤维细胞，也有中间宽两头尖纺锤形状的细胞，细胞质薄而透明，核居中，呈圆形或椭圆形，平均可维持生长5～8周，传代4～6次，随着传代次数的增加，细胞伸长呈梭形，具有成纤维细胞形态(图2-1)。
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2.3 免疫细胞化学染色鉴定 培养细胞中角蛋白染色阴性，波形蛋白、催乳素染色阳性者占90%以上(图2-2，2-3，2-4)，表明培养的细胞纯度达到90%以上。
图2-1子宫内膜间质细胞形态
Fig2-1: Cytomorphological examination of eutopic endometrial primary stromal cells(Light microscope，×200) Eutopic stromal cell of endometriosis
图2-2：免疫组化检测波形蛋白的表达
Fig2-2:Immunohistochemical expression of vimentin(S-P，×100) The positive expression of vimentin in eutopic stromal cell, 百拇医药(王焕萍 黄凤英 刘秋红 邹颖)