HPLC法测定倒扣草中蜕皮甾酮的含量
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摘 要：目的：建立HPLC法测定倒扣草中蜕皮甾酮含量的方法。方法：采用HPLC法，色谱柱为SinoChrom ODS-BP C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈–水体积比(18∶82)；检测波长：248 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL.min-1。结果：蜕皮甾酮在0.25~2.5μg范围内具有良好的线性关系(r＝0.999 8)，平均回收率为98.76%，RSD为0.72%。结论：该方法简便、快速、准确、具有良好的重复性和回收率，可作为蜕皮甾酮的定量分析方法。
关键词：HPLC；倒扣草；蜕皮甾酮
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1007-2349(2011)04-0068-02
倒扣草，别名牛舌大黄、牛舌头、鱼鳞菜[1]，来源于苋科植物粗毛牛膝Achyranthes aspera L.的全草。性凉，味甘淡。有解表清热，利湿活血的功效，用于感冒发热、痢疾、疟疾、咽喉肿痛、脚气、水肿、淋病、跌打损伤等[2]。在全国各地均有分布，在四川是一味民间常用的中草药，用来治疗咽喉炎和扁桃体炎。有文献报道[3]，倒扣草当中含有蜕皮甾酮类物质，药理研究表明，蜕皮甾酮具有明显的抗动脉粥样硬化及抗脂质过氧化作用，能降低血清中胆固醇含量，减少血小板聚集性等作用。
本文以蜕皮甾酮为检测指标，采用高效液相色谱法测定倒扣草中蜕皮甾酮的含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器 戴安高效液相色谱仪(P680A四元低压梯度泵，PDA-100二极管阵列检测器，TCC-100柱温箱，Chromeleon色谱工作站)；瑞士Precisa电子天平(XR 205SM-DR)；CQX25-06超声波清洗器(上海必能信超声有限公司，功率250 W，频率25 kHz)。
1.2 试药 蜕皮甾酮对照品(天津一方科技有限公司，纯度为99.99%)。甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水。倒扣草，2009年9月采自四川省泸州市龙马潭区石洞镇，野生，经笔者鉴别为苋科植物粗毛牛膝的全草。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱为依利特 SinoChrom ODS-BP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈–水体积比(18∶82)；检测波长：248 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL•min-1；进样量：10 μL。见图1。
A.对照品；B. 供试品；1. 蜕皮甾酮
2.2 对照品溶液的制备 取经五氧化二磷减压干燥至恒重的蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇制成每1 mL含蜕皮甾酮0.125 mg/mL的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备 精密称取干燥倒扣草粉末(过40目筛)约2 g，用25 mL 80%甲醇超声提取30 min，过滤，并以甲醇分次洗涤容器和残渣，置水浴锅上挥干溶剂后，用色谱甲醇溶解，并转移至25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
2.4 线性关系考察 精密称取蜕皮甾酮对照品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以进样量(x)与对应的峰面积(Y)作回归处理，得标准曲线。Y=31.2172 x+0.252 3(r=0.999 8)。结果表明，蜕皮甾酮在0.25~2.5 μg，进样量与峰面积间均呈良好的线性关系。
2.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液，注入液相色谱仪，测定峰面积值，重复进样6次。结果倒扣草蜕皮甾酮的RSD为0.29%。表明本法精密度良好。
2.6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0.5、1、2、4、6、8 h分别精密吸取10 μL，测定峰面积值，结果倒扣草蜕皮甾酮的RSD=1.63%。可见供试品溶液在8 h内稳定性良好。
2.7 重复性试验 称取同一批倒扣草粉末5份，按2.3项下方法，制备供试液，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，进行定量测定，结果倒扣草蜕皮甾酮质量分数RSD=0.61%。表明本法重现性良好。
2.8 加样回收率试验 称取已知含量倒扣草药材5份，每份加入适量对照品溶液，按2.3项下方法，制备样品溶液，分别精密吸取样品溶液10 μL，注入液相色谱仪，进行定量测定，计算加样回收率。结果倒扣草蜕皮甾酮的平均加样回收率为98.76%，RSD为0.72%。
2.9 样品测定 分别取上述倒扣草药材样品，按2.3项下方法，制备供试液，分别精密吸取10 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件，分别测定样品中蜕皮甾酮的含量。测定结果见表1。
3 讨论
3.1 提取方法的选择 配制供试品溶液时采取了不同的提取方法(超声、回流、索氏提取)，不同提取溶剂(甲醇、80%甲醇、50%甲醇、水和流动相)，不同溶剂体积(10、25、50、100 mL)及不同提取时间(15、30、45、60 min)分别考察，结果以25 mL 80%甲醇超声提取30 min含量最高 ......
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