北五味子配方颗粒中五味子甲素及乙素的含量测定
摘 要：目的：北五味子配方颗粒中五味子甲素(DSSD)及五味子乙素(r-SSD)含量的HPLC方法学的建立及研究。方法：采用Hypersil C18(Φ 4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇-水(75：25)，流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm。结果：北五味子配方颗粒中DSSD及r-SSD含量在既定的HPLC测定方法下，在0.265~1.590 μg 和0.638~3.188 μg范围内进样量与峰面积的线性关系良好(R=1.0000，R=0.9999)，平均回收率为101.12%和100.38%，RSD(%)值为1.75和1.10。结论：所建立的HPLC测定方法准确、灵敏、重现性好，可用于北五味子颗粒中五味子配方颗粒甲素及乙素的质量控制。
关键词：北五味子配方颗粒；五味子甲素；五味子乙素；HPLC
中图分类号：R282 文献标识码：A
文章编号：1007-2349(2011)08-0067-03
, 百拇医药
中药配方颗粒又称免煎中药，单味中药浓缩颗粒是将单味中药饮片经过科学加工并提取中药材的有效成分，制成的中药饮片新剂型[1]。北五味子配方颗粒剂是以北五味子药材或饮片为原料，经水提取后加适量辅料，浓缩，喷雾干燥，干式制粒而制成的颗粒，临床要求其具有原药材相同的功效[2~4]，用于久咳虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗，盗汗，津伤口渴，短气脉虚，内热消渴，心悸失眠等[5]。本实验依据中药传统汤剂的煎煮方法，建立北五味子颗粒中五味子甲素及乙素含量的HPLC检测方法，现报道如下。
1 仪器和材料
1.1 仪器 美国Agilent 1100 高效液相色谱仪，G1322A-Degasser真空脱气机，G1311A-QuatPump四元泵，G1313A-ALS自动进样器，G1311B-DAD检测器，Agilent Chemstation化学工作站。AND GR202电子分析天平(0.01mg，日本)，CREST超声波清洗器(美国)，旋转蒸发仪RE-52A(上海亚荣生化仪器厂)，KDM型连续可调控温电热套(山东鄄城)。
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1.2 试剂 娃哈哈纯净水(桂林娃哈哈饮用水有限公司)，五味子甲素(批号110764-200405)、五味子乙素(批号110765-200205)由中国药品生物制品检定所提供。HPLC用甲醇为色谱纯，其他化学试剂均为分析纯。北五味子配方颗粒，自制。
2 实验方法及结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil C18(Φ4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(75：25)；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：室温。理论板数按五味子甲素和五味子乙素不低于3000，分离度不低于1.5。
2.2 溶液的配剂
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取取减压干燥至恒重的五味子甲素及五味子乙素对照品适量，分别加甲醇配制成0.100 mg/mL及0.125 mg/mL的溶液，即得。
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2.2.2 供试品溶液的制备 取北五味子颗粒约1.0 g，精密称定，加氯仿3 mL，超声提取30 min，过滤，滤液置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至5 mL量瓶中，作为供试品溶液。
2.3 测定方法 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按确定的色谱条件测定，五味子甲素及五味子乙素与其他成分分离良好，见图1~图3。
2.4 线性关系考察 精密称取五味子甲素对照品5.0 mg，加甲醇溶解，定容至20 mL，精密吸取1、2、3、4、5 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。精密称取五味子乙素对照品6.25 mg，加甲醇溶解，定容至20 mL，精密吸取1、2、3、4、5 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。按上述色谱条件，分别进样10 μL，测定，以峰面积积分Y对五味子甲素及五味子乙素进样量C(μg)进行回归分析，结果五味子甲素得回归方程：Y=1969.96C-0.91，R=1.0000，表明五味子甲素在(0.265~1.590) μg进样范围内呈良好的线性关系。五味子乙素得回归方程为：Y=1925.39C-2.84，R=0.9999，表明五味子乙素在(0.638~3.188) μg进样范围内呈良好的线性关系。
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2.5 仪器精密度考察 取五味子甲素对照品溶液(100.0 μg/mL)及五味子乙素对照品溶液(125.0 μg/mL)，按上述色谱条件，依法操作测定，重复进样6次，测定色谱峰面积，计算RSD(%)值分别为0.149、0.472，说明仪器精密度很好。
2.6 稳定性试验 精密吸取同一批供试品溶液10 μL，按样品溶液制备方法制备样品溶液，在2、4、6、8、24、48、72 h时间间隔进行分析，测定五味子甲素及五味子乙素色谱峰面积，计算RSD(%)值分别为2.02和1.28，表明样品溶液制备后72 h内稳定。
2.7 重复性试验 取同一批号北五味子配方颗粒6份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，测定含量进行分析，结果五味子甲素及五味子乙素的平均含量分别为1.827、4.1657 mg/g，RSD(%)分别为1.84、1.79，表明重复性较好。
2.8 加样回收实验 取已知五味子甲素及五味子乙素准确含量(五味子甲素0.199 mg/g，五味子乙素0.478 mg/g)的样品6份，每份取1.0 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，精密加入2.0 mL五味子甲素(0.103 mg/mL)及4.0 mL五味子乙素对照品溶液(0.126 mg/mL)，挥去甲醇，按样品溶液制备方法制备，分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定五味子甲素及五味子乙素峰面积，计算回收率，结果表明，五味子甲素、五味子乙素加样回收率的平均值分别为100.80%、100.38%，RSD(%)的值分别2.11、1.10，表明所设定的测定方法回收率较好，结果见表1、表2。
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2.9 样品的含量测定 取北五味子配方颗粒8批，按上述方法测定，测得配方颗粒五味子甲素平均含量为0.0215%，五味子乙素平均含量为0.0416%，结果见表3。
3 讨论
中药配方颗粒是近十年来对传统中药饮片应用形式的突破，它主要是在中医药理论的指导下，供中医师临床配方使用，具有免煎易服、作用迅速、成分完全、疗效确切、安全卫生、携带方便等优点，更有利于药房调剂和药材资源的深度开发，有利于中药的标准化和国际化。实验建立了北五味子配方颗粒中五味子甲素及乙素的HPLC测定方法，五味子甲素、乙素分离效果较好，方法简便、迅速。
方法学考察初期，曾用正己烷直接萃取浓缩液3次，将萃取物蒸干，用甲醇溶解定容至5 mL，进样测定，五味子甲素、乙素分离较好；但由于温度等各方面因素的影响，萃取较困难，且用甲醇不能完全溶解萃取液残渣，实验结果不稳定。之后，又尝试将浓缩液直接烘干后，用甲醇超声提取测定，又因浓缩液较难烘干，所以没有采用该法。最终采用氯仿超声提取，提取液蒸干，用甲醇溶解定容至5 mL的方法。结果表明分离效果良好，方法线性、稳定性、重现性、回收率等方法学考察均符合定量测定的要求。目前，为了使配方颗粒的功效及特性尽可能地与中药汤剂接近，国内大部分专家、学者都主张采用水作为提取溶媒。所以在五味子配方颗粒制备过程中，同样也采纳了这一个主张，但是在研究中发现，北五味子提取液中五味子甲素、乙素含量较低，这可能与用水作为溶媒有关，不同批次五味子甲素、乙素含量有一定差异，生产过程中的工艺参数的控制以及原料选取应予以重视。
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参考文献：
[1]诸明娜.免煎中药配方颗粒与传统中药饮片的比较[J].湖北中医杂志，2004，26(11)：55.
[2]国家药品监督管理局.中药配方颗粒管理暂行规定[S].2001.
[3]聂江力，裴毅，祖元刚.北五味子果实超临界CO2萃取工艺的研究[J].植物研究，2005，25(2)：213~215.
[4]杨放，袁军，付平.五味子的研究概况[J].华西药学杂志，2003，18(6)：438~440.
[5]国家药典委员会.中国药典[M].一部.北京：化学工业出版社，2005：44~45.
(收稿日期：2011-04-03), http://www.100md.com(叶绿萍 黄志俭 刘小意 李彬)
关键词：北五味子配方颗粒；五味子甲素；五味子乙素；HPLC
中图分类号：R282 文献标识码：A
文章编号：1007-2349(2011)08-0067-03
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中药配方颗粒又称免煎中药，单味中药浓缩颗粒是将单味中药饮片经过科学加工并提取中药材的有效成分，制成的中药饮片新剂型[1]。北五味子配方颗粒剂是以北五味子药材或饮片为原料，经水提取后加适量辅料，浓缩，喷雾干燥，干式制粒而制成的颗粒，临床要求其具有原药材相同的功效[2~4]，用于久咳虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗，盗汗，津伤口渴，短气脉虚，内热消渴，心悸失眠等[5]。本实验依据中药传统汤剂的煎煮方法，建立北五味子颗粒中五味子甲素及乙素含量的HPLC检测方法，现报道如下。
1 仪器和材料
1.1 仪器 美国Agilent 1100 高效液相色谱仪，G1322A-Degasser真空脱气机，G1311A-QuatPump四元泵，G1313A-ALS自动进样器，G1311B-DAD检测器，Agilent Chemstation化学工作站。AND GR202电子分析天平(0.01mg，日本)，CREST超声波清洗器(美国)，旋转蒸发仪RE-52A(上海亚荣生化仪器厂)，KDM型连续可调控温电热套(山东鄄城)。
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1.2 试剂 娃哈哈纯净水(桂林娃哈哈饮用水有限公司)，五味子甲素(批号110764-200405)、五味子乙素(批号110765-200205)由中国药品生物制品检定所提供。HPLC用甲醇为色谱纯，其他化学试剂均为分析纯。北五味子配方颗粒，自制。
2 实验方法及结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Hypersil C18(Φ4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(75：25)；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：室温。理论板数按五味子甲素和五味子乙素不低于3000，分离度不低于1.5。
2.2 溶液的配剂
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取取减压干燥至恒重的五味子甲素及五味子乙素对照品适量，分别加甲醇配制成0.100 mg/mL及0.125 mg/mL的溶液，即得。
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2.2.2 供试品溶液的制备 取北五味子颗粒约1.0 g，精密称定，加氯仿3 mL，超声提取30 min，过滤，滤液置水浴上蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至5 mL量瓶中，作为供试品溶液。
2.3 测定方法 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，按确定的色谱条件测定，五味子甲素及五味子乙素与其他成分分离良好，见图1~图3。
2.4 线性关系考察 精密称取五味子甲素对照品5.0 mg，加甲醇溶解，定容至20 mL，精密吸取1、2、3、4、5 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。精密称取五味子乙素对照品6.25 mg，加甲醇溶解，定容至20 mL，精密吸取1、2、3、4、5 mL，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。按上述色谱条件，分别进样10 μL，测定，以峰面积积分Y对五味子甲素及五味子乙素进样量C(μg)进行回归分析，结果五味子甲素得回归方程：Y=1969.96C-0.91，R=1.0000，表明五味子甲素在(0.265~1.590) μg进样范围内呈良好的线性关系。五味子乙素得回归方程为：Y=1925.39C-2.84，R=0.9999，表明五味子乙素在(0.638~3.188) μg进样范围内呈良好的线性关系。
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2.5 仪器精密度考察 取五味子甲素对照品溶液(100.0 μg/mL)及五味子乙素对照品溶液(125.0 μg/mL)，按上述色谱条件，依法操作测定，重复进样6次，测定色谱峰面积，计算RSD(%)值分别为0.149、0.472，说明仪器精密度很好。
2.6 稳定性试验 精密吸取同一批供试品溶液10 μL，按样品溶液制备方法制备样品溶液，在2、4、6、8、24、48、72 h时间间隔进行分析，测定五味子甲素及五味子乙素色谱峰面积，计算RSD(%)值分别为2.02和1.28，表明样品溶液制备后72 h内稳定。
2.7 重复性试验 取同一批号北五味子配方颗粒6份，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，测定含量进行分析，结果五味子甲素及五味子乙素的平均含量分别为1.827、4.1657 mg/g，RSD(%)分别为1.84、1.79，表明重复性较好。
2.8 加样回收实验 取已知五味子甲素及五味子乙素准确含量(五味子甲素0.199 mg/g，五味子乙素0.478 mg/g)的样品6份，每份取1.0 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，精密加入2.0 mL五味子甲素(0.103 mg/mL)及4.0 mL五味子乙素对照品溶液(0.126 mg/mL)，挥去甲醇，按样品溶液制备方法制备，分别注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定五味子甲素及五味子乙素峰面积，计算回收率，结果表明，五味子甲素、五味子乙素加样回收率的平均值分别为100.80%、100.38%，RSD(%)的值分别2.11、1.10，表明所设定的测定方法回收率较好，结果见表1、表2。
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2.9 样品的含量测定 取北五味子配方颗粒8批，按上述方法测定，测得配方颗粒五味子甲素平均含量为0.0215%，五味子乙素平均含量为0.0416%，结果见表3。
3 讨论
中药配方颗粒是近十年来对传统中药饮片应用形式的突破，它主要是在中医药理论的指导下，供中医师临床配方使用，具有免煎易服、作用迅速、成分完全、疗效确切、安全卫生、携带方便等优点，更有利于药房调剂和药材资源的深度开发，有利于中药的标准化和国际化。实验建立了北五味子配方颗粒中五味子甲素及乙素的HPLC测定方法，五味子甲素、乙素分离效果较好，方法简便、迅速。
方法学考察初期，曾用正己烷直接萃取浓缩液3次，将萃取物蒸干，用甲醇溶解定容至5 mL，进样测定，五味子甲素、乙素分离较好；但由于温度等各方面因素的影响，萃取较困难，且用甲醇不能完全溶解萃取液残渣，实验结果不稳定。之后，又尝试将浓缩液直接烘干后，用甲醇超声提取测定，又因浓缩液较难烘干，所以没有采用该法。最终采用氯仿超声提取，提取液蒸干，用甲醇溶解定容至5 mL的方法。结果表明分离效果良好，方法线性、稳定性、重现性、回收率等方法学考察均符合定量测定的要求。目前，为了使配方颗粒的功效及特性尽可能地与中药汤剂接近，国内大部分专家、学者都主张采用水作为提取溶媒。所以在五味子配方颗粒制备过程中，同样也采纳了这一个主张，但是在研究中发现，北五味子提取液中五味子甲素、乙素含量较低，这可能与用水作为溶媒有关，不同批次五味子甲素、乙素含量有一定差异，生产过程中的工艺参数的控制以及原料选取应予以重视。
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参考文献：
[1]诸明娜.免煎中药配方颗粒与传统中药饮片的比较[J].湖北中医杂志，2004，26(11)：55.
[2]国家药品监督管理局.中药配方颗粒管理暂行规定[S].2001.
[3]聂江力，裴毅，祖元刚.北五味子果实超临界CO2萃取工艺的研究[J].植物研究，2005，25(2)：213~215.
[4]杨放，袁军，付平.五味子的研究概况[J].华西药学杂志，2003，18(6)：438~440.
[5]国家药典委员会.中国药典[M].一部.北京：化学工业出版社，2005：44~45.
(收稿日期：2011-04-03), http://www.100md.com(叶绿萍 黄志俭 刘小意 李彬)