高效液相色谱法测定不同产地珠子参中人参皂苷Re的含量
摘要：目的建立高效液相色谱法测定珠子参中人参皂苷Re含量的方法。方法
选用XTerra MS C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以0.05%磷酸-乙腈(55.45)为流动相，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为203nm。结果 在0.992-11.904μg范围内，人参皂苷Re呈良好的线性关系，r=0.9999。得平均回收率为96.41%，RSD=1.59%(n=6)。不同产地珠子参中人参皂苷Re的含量不同，其中丽江产的含量最高，德钦产的次之。结论本法准确、分离度高，可用于珠子参中人参皂苷Re的含量测定。
关键词：珠子参；人参皂苷Re；高效液相色谱法
中图分类号：R284 文献标志码：A 文章编号：1007-2349(2017)03-0075-02
珠子参，别名珠儿参、野三七、钮子七、疙瘩七等。为五加科植物人参属珠子参Panax japonicus C.A.May.vat.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng或羽叶三七PanaxjaponicusC.A.May.vat.bipinnatifidus(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根茎。味苦、甘，微寒。归肝、肺、胃经。具有补肺，养阴，活络，止血之功。用于气阴两虚，烦热口渴，虚劳咳嗽，跌打损伤，关节疼痛，咳血，吐血，外伤出血。在云南民间代三七使用。主产云南、四川、陕西等地。具有较高的药用价值。传统习用珠子参根茎中的膨大节，而对其细小的节间少用或限用，而对于地上部分更是弃之不用，而同科同属的人参、三七等药材早已充分利用地上部分并建立相应质量标准。为了充分利用植物资源，本文选取珠子参地下部分和地上部分中均含有人参皂苷Re这一成分，对不同产地的珠子参地上部分及地下部分进行定量分析比较。目前，用高效液相色谱法测定珠子参中人参皂苷Re的文献报道不多，本文建立了相应的测定方法，为进一步开发利用植物资源提供了理论依据及实际指导意义。
1仪器与试药
1.1仪器 LC-2010A日本岛津高效液相色谱仪，LCsolution工作站；FA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司，精度0.1 mg)。
1.2试药 人参皂苷Re对照品(批号：110754-201324，含量测定用)购于中国药品生物制品检定所。珠子参药材由云南省药物研究所制药厂提供，采收于云南德钦、大姚、丽江。经云南省药物所究所天然药物资源研究中心高丽正高级工程师鉴定为五加科植物人参属珠子参Panax japonicusC.A.May.vat.major(Burk.)C.Y.Wu et KM.Feng或羽叶三七Panax japonicus C.A.May.vat.bipinnatifidus(Burk.)c.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根茎。甲醇、乙睛为色谱纯(美国Fisher公司)，其他试剂均为分析纯。水为超纯水(18.21)Pa)，0.45微米滤膜(安捷伦公司)，磷酸及其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件 Waters XTerra MS C18(4.6 mm x250mm，5 tun)；流动相为0.05%磷酸：乙腈=体积比55：45；流速1.0 mlVmin，柱温30℃，检测波长为203 nm；进样量为10μL；理论塔板数按人参皂苷Re计算应不低于6000(见图1)。
2.2对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Re对照品0.01984 g，置于10 mL容量瓶中加甲醇稀释至刻度，得浓度为1.984 mg/m1的人参皂苷Re对照品储备液，备用。使用前过0.45 μm的微孔滤膜。
2.3供试品溶液的制备 取药材粉末约1 g，精密称定，加25 mL水饱和的正丁醇使充分溶解，水浴回流1.5 h。滤过提取液，滤液蒸干，残渣加适量的甲醇溶解，并转移至10 mL容量瓶中摇匀，定容，用0.45 nm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.4线性关系的考察 精密吸取“2.2”项下對照品溶液1、4、8、12、16μl按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标X，峰面积(A)为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程：Y=1E+06X+16376，r=0.9999，(n=6)。结果表明，人参皂苷Re在0.992-11.9041.Lg范围内呈良好的线性关系。
2.5精密度试验 精密吸取同一浓度的人参皂苷Re对照品溶液10μL，重复进样6次，分别测定峰面积值，得峰面积平均值为6562712，RSD=0.36%(n=6)，精密度良好。
2.6重现性试验 取同一批药材5份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别测定人参皂苷Re的含量。结果样品平均含量为1.3475%，RSD为0.3660%(n=6)。结果表明该方法重现性良好。
2.7稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后的0、2、4、6、8、12 h依法测定其含量，结果人参皂苷Re的平均含量为1.3220%，RSD=1.6451%(n=6)。表明该溶液在12 h内基本稳定。
2.8加样回收率试验 取6份已知含量的同一批药材各约0.1 g，精密称定，分别加入一定量的人参皂苷Re对照品溶液，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定。得平均加样回收率为96.41%，RSD=1.59%(n=6)。说明该方法准确可靠。见表1。
2.9样品测定 取珠子参样品按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依照“2.1”色谱条件进行测定，结果见表2。
3讨论
3.1流动相的选择 参照各参考文献对人参皂苷Re的高效液相测定，对流动相水、0.1%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液、乙腈组合进行优选，并对其比例进行调整，结果0.05%磷酸：乙腈=55：45能很好的将其分离。
3.2提取方法的筛选 笔者对本试验的样品提取方法进行了单因素考察，分别就提取回流时间、提取方法、提取溶剂进行了筛选，结果发现回流时间1h和1.5h所得人参皂苷Re含量相差不大，但对于前面的杂质峰回流时间越长峰越小，故最终选择了1.5h的回流时间；提取方法方面考察了冷浸法、热回流法、超声+回流法，结果热回流法人参皂苷Re含量明显高于其他两种方式；其次，还分别考察了以甲醇、95%乙醇、75%乙醇、水饱和的正丁醇、三氯甲烷为提取溶剂的人参皂苷Re的含量测定，75%乙醇溶液的提取率最高，但其分离度差，杂质峰较多，水饱和的正丁醇提取率次之，但分离度较好，故选用水饱和的正丁醇做溶媒。故最终将回流时间定为1.5h，提取方法为热回流法，提取溶剂为水饱和的正丁醇。
3.4产地及不同药用部位的对比 通过测定各个产地珠子参药材中的人参皂苷Re的含量，结果显示，无论是根茎中的节和节间，还是地上部分与地下部分之间的含量差异都很小。从各产地情况看，丽江产的含量最高，德钦次之，另外两个产地石林与楚雄的相差不大。这可能与各地的气候、温度及生长环境等有关。其次，但在实际生活中，人们习惯用其膨大的节间，而对其细长的节间是限用或不用。就人参皂苷Re的含量来看，其节及节间相差不大，可以充分利用其节间入药，以扩大药用部位及有效利用自然资源。
人参皂苷Re是珠子参的有效成分之一，且在珠子参的地上及地下部分均含有。采用高效液相色谱法对该成分进行了测定，方法简单、准确，对扩大药用部位，合理开发药用植物资源提供了理论依据及实际指导意义。
(收稿日期：2016-11-28), 百拇医药(许银凤 蔡苇)
选用XTerra MS C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，以0.05%磷酸-乙腈(55.45)为流动相，流速1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为203nm。结果 在0.992-11.904μg范围内，人参皂苷Re呈良好的线性关系，r=0.9999。得平均回收率为96.41%，RSD=1.59%(n=6)。不同产地珠子参中人参皂苷Re的含量不同，其中丽江产的含量最高，德钦产的次之。结论本法准确、分离度高，可用于珠子参中人参皂苷Re的含量测定。
关键词：珠子参；人参皂苷Re；高效液相色谱法
中图分类号：R284 文献标志码：A 文章编号：1007-2349(2017)03-0075-02
珠子参，别名珠儿参、野三七、钮子七、疙瘩七等。为五加科植物人参属珠子参Panax japonicus C.A.May.vat.major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng或羽叶三七PanaxjaponicusC.A.May.vat.bipinnatifidus(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根茎。味苦、甘，微寒。归肝、肺、胃经。具有补肺，养阴，活络，止血之功。用于气阴两虚，烦热口渴，虚劳咳嗽，跌打损伤，关节疼痛，咳血，吐血，外伤出血。在云南民间代三七使用。主产云南、四川、陕西等地。具有较高的药用价值。传统习用珠子参根茎中的膨大节，而对其细小的节间少用或限用，而对于地上部分更是弃之不用，而同科同属的人参、三七等药材早已充分利用地上部分并建立相应质量标准。为了充分利用植物资源，本文选取珠子参地下部分和地上部分中均含有人参皂苷Re这一成分，对不同产地的珠子参地上部分及地下部分进行定量分析比较。目前，用高效液相色谱法测定珠子参中人参皂苷Re的文献报道不多，本文建立了相应的测定方法，为进一步开发利用植物资源提供了理论依据及实际指导意义。
1仪器与试药
1.1仪器 LC-2010A日本岛津高效液相色谱仪，LCsolution工作站；FA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司，精度0.1 mg)。
1.2试药 人参皂苷Re对照品(批号：110754-201324，含量测定用)购于中国药品生物制品检定所。珠子参药材由云南省药物研究所制药厂提供，采收于云南德钦、大姚、丽江。经云南省药物所究所天然药物资源研究中心高丽正高级工程师鉴定为五加科植物人参属珠子参Panax japonicusC.A.May.vat.major(Burk.)C.Y.Wu et KM.Feng或羽叶三七Panax japonicus C.A.May.vat.bipinnatifidus(Burk.)c.Y.Wu et K.M.Feng的干燥根茎。甲醇、乙睛为色谱纯(美国Fisher公司)，其他试剂均为分析纯。水为超纯水(18.21)Pa)，0.45微米滤膜(安捷伦公司)，磷酸及其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件 Waters XTerra MS C18(4.6 mm x250mm，5 tun)；流动相为0.05%磷酸：乙腈=体积比55：45；流速1.0 mlVmin，柱温30℃，检测波长为203 nm；进样量为10μL；理论塔板数按人参皂苷Re计算应不低于6000(见图1)。
2.2对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Re对照品0.01984 g，置于10 mL容量瓶中加甲醇稀释至刻度，得浓度为1.984 mg/m1的人参皂苷Re对照品储备液，备用。使用前过0.45 μm的微孔滤膜。
2.3供试品溶液的制备 取药材粉末约1 g，精密称定，加25 mL水饱和的正丁醇使充分溶解，水浴回流1.5 h。滤过提取液，滤液蒸干，残渣加适量的甲醇溶解，并转移至10 mL容量瓶中摇匀，定容，用0.45 nm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.4线性关系的考察 精密吸取“2.2”项下對照品溶液1、4、8、12、16μl按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，以进样量(μg)为横坐标X，峰面积(A)为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程：Y=1E+06X+16376，r=0.9999，(n=6)。结果表明，人参皂苷Re在0.992-11.9041.Lg范围内呈良好的线性关系。
2.5精密度试验 精密吸取同一浓度的人参皂苷Re对照品溶液10μL，重复进样6次，分别测定峰面积值，得峰面积平均值为6562712，RSD=0.36%(n=6)，精密度良好。
2.6重现性试验 取同一批药材5份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别测定人参皂苷Re的含量。结果样品平均含量为1.3475%，RSD为0.3660%(n=6)。结果表明该方法重现性良好。
2.7稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于制备后的0、2、4、6、8、12 h依法测定其含量，结果人参皂苷Re的平均含量为1.3220%，RSD=1.6451%(n=6)。表明该溶液在12 h内基本稳定。
2.8加样回收率试验 取6份已知含量的同一批药材各约0.1 g，精密称定，分别加入一定量的人参皂苷Re对照品溶液，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定。得平均加样回收率为96.41%，RSD=1.59%(n=6)。说明该方法准确可靠。见表1。
2.9样品测定 取珠子参样品按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依照“2.1”色谱条件进行测定，结果见表2。
3讨论
3.1流动相的选择 参照各参考文献对人参皂苷Re的高效液相测定，对流动相水、0.1%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液、乙腈组合进行优选，并对其比例进行调整，结果0.05%磷酸：乙腈=55：45能很好的将其分离。
3.2提取方法的筛选 笔者对本试验的样品提取方法进行了单因素考察，分别就提取回流时间、提取方法、提取溶剂进行了筛选，结果发现回流时间1h和1.5h所得人参皂苷Re含量相差不大，但对于前面的杂质峰回流时间越长峰越小，故最终选择了1.5h的回流时间；提取方法方面考察了冷浸法、热回流法、超声+回流法，结果热回流法人参皂苷Re含量明显高于其他两种方式；其次，还分别考察了以甲醇、95%乙醇、75%乙醇、水饱和的正丁醇、三氯甲烷为提取溶剂的人参皂苷Re的含量测定，75%乙醇溶液的提取率最高，但其分离度差，杂质峰较多，水饱和的正丁醇提取率次之，但分离度较好，故选用水饱和的正丁醇做溶媒。故最终将回流时间定为1.5h，提取方法为热回流法，提取溶剂为水饱和的正丁醇。
3.4产地及不同药用部位的对比 通过测定各个产地珠子参药材中的人参皂苷Re的含量，结果显示，无论是根茎中的节和节间，还是地上部分与地下部分之间的含量差异都很小。从各产地情况看，丽江产的含量最高，德钦次之，另外两个产地石林与楚雄的相差不大。这可能与各地的气候、温度及生长环境等有关。其次，但在实际生活中，人们习惯用其膨大的节间，而对其细长的节间是限用或不用。就人参皂苷Re的含量来看，其节及节间相差不大，可以充分利用其节间入药，以扩大药用部位及有效利用自然资源。
人参皂苷Re是珠子参的有效成分之一，且在珠子参的地上及地下部分均含有。采用高效液相色谱法对该成分进行了测定，方法简单、准确，对扩大药用部位，合理开发药用植物资源提供了理论依据及实际指导意义。
(收稿日期：2016-11-28), 百拇医药(许银凤 蔡苇)