木贼有效部位抑制氧化低密度脂蛋白致内皮细胞凋亡及Caspase—3的表达(1)
摘要：目的探讨木贼有效部位抑制氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC-ECV304)凋亡的可能机制。方法体外ox-LDL诱导人脐静脉内皮细胞损伤，用木贼有效部位进行干预；采用流式细胞术检测细胞凋亡率及Caspase-3蛋白；反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮细胞Caspase-3mRNA表达。结果ox-LDL可明显诱导内皮细胞凋亡，上调Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白表达，木贼有效部位干预后细胞凋亡率明显下降(P<0.05)，Caspase-3mRNA及Caspase-3蛋白表达明显下调(P<0.01)。结论木贼有效部位通过对凋亡相关基因的调控最终抑制Caspase-3蛋白的表达来减少内皮细胞的凋亡。
关键词：木贼；有效部位；氧化低密度脂蛋白；内皮细胞；凋亡；Caspase-3
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349(2017)06-0071-03
【Abstract】Objective： To study the possible mechanism of inhibiting human umbilical vein endothelial cells (HUVEC-ECV304) apoptosis induced by oxidized low density lipoprotein (ox-LDL). Methods： Ox-LDL in vitro was used to induce human umbilical vein endothelial cell injury and effective part of Equisetum was used to intervene. Flow cytometry was used to detect cell apoptotic rate and Caspase-3 protein and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect endothelial cell Caspase-3 mRNA expression. Results： Ox-LDL could induce the apoptosis of endothelial cells and up-regulate Caspase-3 mRNA and Caspase-3 protein expression. The apoptotic rate significantly decreased (P<0.05) after the intervention of the effective part of Equisetum and Caspase-3 mRNA and Caspase-3 protein expression obviously down-regulated (P<0.01). Conclusion： The effective part of Equisetum can inhibit the apoptosis of endothelial cells by controlling the expression of Caspase-3 protein through regulating apoptosis-related genes.
【Key words】Equisetum， effective part， oxidized low density lipoprotein， endothelial cell， apoptosis， Caspase-3
木賊为多年生草本植物，药用部位为木贼的干燥地上部分，传统用于“疏风散热、解肌退翳”等作用，现代研究证实其有抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的作用[1]。本课题组证实木贼大孔树脂提取物中主要含黄酮及芬酸类化合物，这两种成分对氧化低密度脂蛋白损伤的内皮细胞有保护作用，且笔者初步阐明其保护内皮细胞是通过抗内皮细胞凋亡机制来实现的[2-3]。本实验通过研究木贼提取物对ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)的凋亡及Caspase-3mRNA与Caspase-3蛋白水平表达的影响，进一步探讨木贼保护内皮细胞抗凋亡的具体途径，为木贼抗动脉粥样硬化的下一步开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器CO2恒温培养箱，美国Revco；756MC型紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；Gen Amp5700型PCR仪，美国PE公司；FR-200A凝胶扫描系统，上海复日科技有限公司；微量移液器，美国eppendorf；Epics-XLⅡ型流式细胞仪，美国B-C公司；木贼饮片，购于石家庄市乐仁堂大药房，经河北医科大学中医学院中药系鉴定；槲皮素和阿魏酸标准品，中国药品生物制品检定所，批号0080-9705，0773-9910；D101型大孔树脂，天津大均科技开发有限公司；人脐静脉内皮细胞株ECV304，武汉大学中国动植物保存中心；新生小牛血清，四季青公司；DMEM培养液及胰酶，GIBCO公司；总RNA提取试剂(TRIzol)、cDNA第一链合成试剂盒、PCR试剂盒及DNA Marker，均为北京TIANGEN公司；PCR引物，北京三博远志生物公司；Caspase-3鼠抗人多克隆抗体，美国Santa Cruz公司；羊抗兔IgG-PE二抗，美国Santa Cruz公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2木贼有效部位的制备称取适量木贼饮片置于圆底烧瓶中，加12倍量的70%的乙醇浸泡2h，电热套加热回流提取3次，每次2h，过滤并合并滤液，得木贼提取液。称取大孔树脂40 g，将提取液上树脂柱，先以水冲至洗脱液近无色后(Molish反应阴性)分别用蒸馏水，30%乙醇，70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液作为测试样品，分别以槲皮素和阿魏酸为对照品用紫外分光光度计检测此样品中总黄酮和总酚酸含量并测定其纯度。将70%乙醇洗脱液减压浓缩后，用无血清培养基DMEM将样品稀释，以二甲基亚砜(DMSO)使其充分溶解，此为用于本实验的木贼有效部位。, http://www.100md.com(李志永 李红艳 庞鑫 李秀芬 孔芳)
关键词：木贼；有效部位；氧化低密度脂蛋白；内皮细胞；凋亡；Caspase-3
中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349(2017)06-0071-03
【Abstract】Objective： To study the possible mechanism of inhibiting human umbilical vein endothelial cells (HUVEC-ECV304) apoptosis induced by oxidized low density lipoprotein (ox-LDL). Methods： Ox-LDL in vitro was used to induce human umbilical vein endothelial cell injury and effective part of Equisetum was used to intervene. Flow cytometry was used to detect cell apoptotic rate and Caspase-3 protein and reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect endothelial cell Caspase-3 mRNA expression. Results： Ox-LDL could induce the apoptosis of endothelial cells and up-regulate Caspase-3 mRNA and Caspase-3 protein expression. The apoptotic rate significantly decreased (P<0.05) after the intervention of the effective part of Equisetum and Caspase-3 mRNA and Caspase-3 protein expression obviously down-regulated (P<0.01). Conclusion： The effective part of Equisetum can inhibit the apoptosis of endothelial cells by controlling the expression of Caspase-3 protein through regulating apoptosis-related genes.
【Key words】Equisetum， effective part， oxidized low density lipoprotein， endothelial cell， apoptosis， Caspase-3
木賊为多年生草本植物，药用部位为木贼的干燥地上部分，传统用于“疏风散热、解肌退翳”等作用，现代研究证实其有抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的作用[1]。本课题组证实木贼大孔树脂提取物中主要含黄酮及芬酸类化合物，这两种成分对氧化低密度脂蛋白损伤的内皮细胞有保护作用，且笔者初步阐明其保护内皮细胞是通过抗内皮细胞凋亡机制来实现的[2-3]。本实验通过研究木贼提取物对ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC)的凋亡及Caspase-3mRNA与Caspase-3蛋白水平表达的影响，进一步探讨木贼保护内皮细胞抗凋亡的具体途径，为木贼抗动脉粥样硬化的下一步开发利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与仪器CO2恒温培养箱，美国Revco；756MC型紫外-可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；Gen Amp5700型PCR仪，美国PE公司；FR-200A凝胶扫描系统，上海复日科技有限公司；微量移液器，美国eppendorf；Epics-XLⅡ型流式细胞仪，美国B-C公司；木贼饮片，购于石家庄市乐仁堂大药房，经河北医科大学中医学院中药系鉴定；槲皮素和阿魏酸标准品，中国药品生物制品检定所，批号0080-9705，0773-9910；D101型大孔树脂，天津大均科技开发有限公司；人脐静脉内皮细胞株ECV304，武汉大学中国动植物保存中心；新生小牛血清，四季青公司；DMEM培养液及胰酶，GIBCO公司；总RNA提取试剂(TRIzol)、cDNA第一链合成试剂盒、PCR试剂盒及DNA Marker，均为北京TIANGEN公司；PCR引物，北京三博远志生物公司；Caspase-3鼠抗人多克隆抗体，美国Santa Cruz公司；羊抗兔IgG-PE二抗，美国Santa Cruz公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.2木贼有效部位的制备称取适量木贼饮片置于圆底烧瓶中，加12倍量的70%的乙醇浸泡2h，电热套加热回流提取3次，每次2h，过滤并合并滤液，得木贼提取液。称取大孔树脂40 g，将提取液上树脂柱，先以水冲至洗脱液近无色后(Molish反应阴性)分别用蒸馏水，30%乙醇，70%乙醇洗脱，收集70%乙醇洗脱液作为测试样品，分别以槲皮素和阿魏酸为对照品用紫外分光光度计检测此样品中总黄酮和总酚酸含量并测定其纯度。将70%乙醇洗脱液减压浓缩后，用无血清培养基DMEM将样品稀释，以二甲基亚砜(DMSO)使其充分溶解，此为用于本实验的木贼有效部位。, http://www.100md.com(李志永 李红艳 庞鑫 李秀芬 孔芳)