一种高效而经济获得长片段基因突变体的方法
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摘 要：重组PCR方法的发展为体外突变技术提供了更快捷、准确的方法。通过改进引物设计和PCR保真性等方法，应用重叠延伸PCR的原理成功地实现了对BA基因的定点突变，并构建了其含有m1，m2，m3和m4的突变体。实验证明通过这种改进方法可以有效地进行长片段基因的突变，并且这种方法与其他方法相比具有简便、快捷、经济、高效的特点。
关键词：定点突变；重叠延伸PCR(OE PCR)；基因
中图分类号：Q785
文献标识码：A
文章编号：1007—7847(2006)01—0034—05
体外定点突变技术是研究基因、蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具，也是实验室中改造或优化基因常用的手段。缺失、插入或替换特定碱基的定点突变可用不同的方法来实现。目前已报道的以PCR为基础的各种诱变方法中，“重叠延伸法”和“大引物法”比较突出，在此基础上发展的“一步PCR方法”也有一定的应用范围。这些方法虽然都有各自的优点，但其诱变率却不理想。
本研究中突变的基因(BA)长度较大(3，0kb)，我们拟将它的4个丝氨酸(Ser)位点(m1，m2，m3和m4)通过碱基置换变为编码丙氨酸(AIa)的位点，预突变的位置都位于基因中后段，综合这些特点，本研究通过改进引物设计和PCR保真性等方法应用重叠延伸PCR(overlap exten-sionPCR，OEPCR)原理实现了对BA基因的定点突变并构建了突变体。实验证明了此种改良方法简便、快捷、经济而又突变准确，尤其适用于长片段基因的定点突变。
1 材料和方法
1.1 材料
T4DNA连接酶购自NEB公司，T4DNA聚合酶，限制性内切酶KpnI、XhoI与dNTPs及凝胶纯化回收试剂盒(DV805A)均购自TaKaRa公司，引物合成于TaKaRa公司，PfuUltraTMDNA高保真聚合酶购自Stratagene公司，pOTB7-BA质粒，克隆载体pcDNA3，1 HisA购自lnvitrogen公司 ......
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