一种MicroRNA dupkex设计新技术研究(2)
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同样也可以决定siRNAdulex对靶基因的抑制效率。最终的确定的miRNAduplex序列，见表2。
3 讨论
目前，对于微RNA的功能研究，主要还是通过构建相应的miRNAs表达载体得以实现。Zeng等利用分子克隆技术将能够表达miR-30的表达框克隆到pCMV质粒中，构建了稳定表达的pCMV-miR-30质粒，该质粒可以在RNA聚合酶Ⅱ的作用下表达miR-30。而Chen等采用类似的方法构建了依赖RNA聚合酶Ⅲ的逆转录病毒表达质粒，在不同细胞中表达了几种与造血功能有相关的miRNAs(包括miR-223、mir-181、mir-142)。尽管如此，构建某一个miRNA的表达载体并非易事，更何况microRNA家族成员已经如此庞大，且又存在物种间的差异。因此，有必要找到一种便捷、且行之有效的方法，加快对于微RNA功能的进一步研究。
前面提到，siRNA的制备可以有多种方法，但化学合成法一直被认为是最可靠而便捷的方法。Elbashir等研究发现3＇端带有2个突出碱基的2Int的siRNA在诱发序列特异性mRNA降解中最为有效。因此，也有不少研究者试图采用直接合成的方法来研究微RNA的功能。尽管可以借鉴siRNA设计的一些原则，但微RNA的设计又有其自身的特点，本研究讨论了一种简单、方便的微RNA设计方法。我们利用RISC形成过程中的不对称性与siRNA功能性之间的关系，同时在设计miRNAduplex的过程中，互补区的内部稳定性直接决定了miRNA的功能性。采用Oligo6.0软件及最邻近法对互补区的热动力学特点进行评价，从而对某些不合适的位点进行调整，以获得功能性的miRNAduplex。当然，这种调整并非是固定了，在设计中可以灵活运用。
对于理论上所设计的微RNA的有效性，还需要实验来进一步验证。Lim等通过基因芯片技术研究了几种化学合成的miRNA及其靶向的mRNA，也证实了化学合成方法的有效性。我们采用生物信息学的方法对上述实验中的几个微RNA进行分析，结果满足热动力学的要求。同时，我们利用这种方法设计并合成mir-181a du-plex，转染K562细胞，进而对mir—181a的功能和靶基因进行了预测和分析，也取得了较好的结果(结果尚未发表)。由此可见，利用该方法来设计特定的miRNA，不仅是一种简便可行、准确有效的方法，而且将有助于加快miRNA的功能及相关研究。
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