Gβ类似蛋白-WDR26对细胞增殖的影响(2)

http://www.100md.com 2006年6月1日 朱传炳　曾伟奇　朱　莹　李大力　袁婺洲　王跃群　李永青　梁宋

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     min，取血清分装保存于-80℃下。通过印记亲和吸附法纯化抗体。

    1.3 Western Blotting

    收获一个10cm细胞培养皿(细胞密度80%)中的细胞，使用MRCgene公司的试剂盒一次性制备蛋白质、DNA和RNA(操作步骤按公司说明进行)。蛋白质浓度测定按照Bradford方法进行。

    按照标准程序制备10%SDS—聚丙烯酰胺凝胶，取10μL(50/xg)蛋白样品溶液，用等体积的2μSDS凝胶加样缓冲液稀释，95℃水浴3min，以使蛋白质变性，按顺序用微量注射器点样，接通电源，恒压96V电泳，溴酚蓝跑过积层胶后，恒定电压150V。直到溴酚蓝迁移到距胶的底部1cm处时，即停止电泳。

    PVDF膜(购自Millipore公司)依次用甲醇预处理15s，去离子水浸润5min，转膜缓冲液浸润5～10min。使用半干电转法(北京六一仪器厂，DYCP-40C)把蛋白质转到PVDF膜上，稳流80mA(2.5 mA/cm²)，电转1.5～2.0h.凝胶经考马斯亮蓝染色，膜经1×丽春红染色，以确认转膜效果。在膜上作好标记后，用TBST漂洗数次，除去丽春红。

    实验前用TBST(含1%脱脂奶粉)将膜在4℃下封闭过夜(缓慢摇动)。用TBST的稀释一抗(WDR26特异性多克隆抗体 ......

    http://www.100md.com/html/paper/1007-7847/2006/02/07-1.htm

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