一个鼻咽癌相关EST的鉴定及其全长cDNA序列分析(2)
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参见附件(683KB，6页)。
序，进行生物信息学分析。
2 结果
2.1 EST的筛选
进入美国国家生物技术信息中心(NCBl)网站，首先在EST数据库(http：//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html)输入3号染色体区带信息，找到几十条EST，然后在Genemap(http：//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/map.cgi)直接点击3号染色体相应区带，查找到几百条EST。对查找到的所有ESTs利用blastn程序(http：//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行同源性比较、分析，剔除代表已克隆基因的EST和来源于同一族的EST。我们选择EST的标准是：1)与已知基因同源性小于50%，代表未克隆基因；2)序列长度大于400bp；3)尽可能地来源于染色体3p21区域，并有关于染色体定位信息的说明；4)序列中不含Alu重复序列。据此，我们筛选到46个满足以上条件的EST，选取20个EST进行RT-PCR扩增，对表达下调的EST用PCR产物标记探针，然后进行Northern杂交。
2.2 RT-PCR检测结果
对EST的部分RT-PCR检测结果见图1。结果表明，ESTBG772301在41.18%(14/34例)的鼻咽癌组织和20.0%(1/5株)的鼻咽癌细胞系中mR—NA的表达水平低于成人正常鼻咽组织。此外，在1例白血病细胞系(HL-60)中也明显表达下调。
2.3 Northern杂交结果
用EST BG772301和GAPDH的PCR产物标记探针，对MTNTMBlot人多种正常组织RNA膜进行杂交，结果发现：ESTBG772301在人多种正常组织中都有表达，相对而言，人胎盘、肺及肝组织中阳性杂交信号较弱，而人心、脑、骨骼肌、肾及胰腺组织均有较强的阳性杂交信号，说明ESTBG772301所代表的基因较为保守。另外，结果还显示该基因的转录本大小约为2.4kb左右，而内对照GAPDH在人多种正常组织中的阳性杂交信号无强弱的差别，表明各泳道RNA量基本一致(图2)。
2.4 全长cDNA克隆测序和生物信息学分析
我们通过对cDNA质粒克隆(IMAGE：4839190)测序，获得了一个全长为2 377 bp的cDNA序列 ......
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