小肽基因合成及其串联体表达载体的构建(1)
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参见附件(547KB，5页)。
摘 要：以人表皮生长因子为研究对象，分3段合成了hegf基因片段，运用套叠PCR技术进行连接，形成全长hegf(159 bp)并克隆到酵母表达载体pGAPZα-A中，利用同裂酶技术构建串联体表达载体，获得了分别含2、3、4拷贝的串联体表达载体pGAPZα-2hegf、pGAPZα-3hegf和pGAPZα-4hegf,为下一步进行基因表达及其生物学活性分析奠定了基础。
关键词：hegf基因合成；串联体；载体构建
中图分类号：Q782
文献标识码：A
文章编号：1007-7847(2007)01-0033-05
表皮生长因子最初由Cohen及其同事从小鼠颌下腺分离得到，后在人尿中分离得到，人表皮生长因子(hEGF)是由53个氨基酸组成的小分子多肽，含有3个链内二硫键，结构稳定，研究表明，hEGF具有多种生物学功能，它通过与细胞膜上hEGF受体结合，促使细胞内部发生一系列复杂的生化级联反应而发挥生理作用，如它可促进细胞分裂，修复皮肤创伤、胃肠溃疡、角膜损伤等；防止皮肤衰老，起到美白嫩肤的作用；靶向性结合含高密度hEGF受体的肿瘤组织，大剂量的EGF还能抑制某些癌细胞的生长，商品化的hEGF具有很高的市场价值，且市场需求量大，提高其表达量及生物学活性可广泛用于临床，满足市场的需要。
利用基因重组技术是大量制备活性多肽的有效方法，通常将少于100个氨基酸的肽称为小分子多肽，由于其相对分子质量较小，在体内易被迅速水解，半衰期短，因此在克隆、表达等都会碰到不少困难，本研究利用套叠PCR技术合成了hegf基因，在构建酵母分泌型表达载体时，采取多拷贝串联构建，并在各拷贝间引入kex2蛋白酶切位点，以便在毕赤氏酵母中表达时能切割形成单个的hEGF分子，本研究探索了基因合成方法和小分子多肽表达载体构建策略，为实现小分子多肽在体外的高效表达提供了参考依据，并为hEGF在酵母中串联表达奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒和菌株
菌株E.coli DH5α由本室保存，菌株ToplOF’、载体pGAPZα-A购自Invitrogen公司，pMD18-T vector购自TaKaRa公司。
1.1.2 生化试剂
Taq聚合酶、T4-DNA连接酶、Xho I、Xba I购自TaKaRa公司，AvaⅢ、Pst I购自Fermentas公司，DNA Maker购自Tiangen公司，UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)有限公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 基因片段与引物
选用毕赤酵母偏爱密码子，根据NCBI上报道的序列(E02089)分3段合成hegf基因：1)hegf基因片段1(hegfl)：aac tcc gac tct gaa tgc ccg ctgtcc cac gat ggt tac tgc ctg cac gac ggc gtt tgt atg；2) hegf2：ctg ccg caa aca tac ata tag ctc cgc gac ctg tttata cgc aca ttg aca cat cat ccg atg；3)hegf3：tgt gta gta ggc tac atc ggc gaa cgc tgc cag tac cgt gac ctg aaatgg tgg gaa ctg cgc；4)引物l(P1)：g ctcgag atgcataagaga aac tcc gac tct g；5)引物2(P2)：t gta gcc tactac aca gtt ac；6)引物3(P3)：t tctaga ctgcag gcg cagttc tea cc.hegf2片段划线部分分别与hegf1和hegf3划线部分互补，引物P1和P3分别引入XhoI和Xba I酶切位点，基因片段及引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 套叠PCR连接egf1和egf2基因片段
利用egf1和ear2部分互补及引物P1和P2，在同一个PCR反应中，采用不同的退火温度，先使egf1和egf2延伸，再用P1和P2进行扩增，得到egf1-ear2片段，PCR程序如下：94℃5min；94℃30s，41℃30s，72℃30s，10个循环；94℃30s，53℃30s，72℃30s，25个循环；72℃7min；4℃+∞。
1.2.2 egf3互补链的产生
在P3引物存在下，利用Klenow Fragment在37℃延伸3h，使egf3形成互补链。
1.2.3套叠PCR连接egf1-egf2和egf3片段
利用两个片段的互补及引物P1、P3，如1.2.1采用不同的退火温度扩增得到hegf全长，PCR程序如下：94℃5 min；94℃30s，39℃30s，72℃30s，10个循环；94℃30s，53℃30s，72℃30s，25个循环；72℃7min；4℃+∞。
1.2.4 pGAPZα-hegf的获得
先将hegf克隆到pMD18-T vector并转化DH5α，大量提取质粒后，利用Xho I和Xba I将hegf克隆到pGAPZα-A，并转化Top1OF’。
1.2.5 串联表达载体的构建
利用同裂酶AvaⅢ(ATGCA↓T)和Pst I(cTGCA ↓ G)酶切重新连接后形成ATGCA l G而不再被AvaⅢ和Pst I识别的特点，利用Xho I和AvaⅢ酶切pGAPZα-hEGF回收大片段，用Xho I和Pst I酶切pGAPZα-hegf回收小片段，再用T4-DNA连接酶连接大小片段，构建二拷贝载体pGAPZα-2hegf，同样原理，利用Xho I/AvaⅢ和Xho I/Pst I酶切pGAPZα-2hegf,再用连接酶连接可得到pGAPZα-3hegf和pGAPZα-4hegf。
2 结果
2.1 套叠PCR扩增结果
hegf基因片段在引物P1和P2作用下，采用不同的退火温度，得到egf1-egf2片段(如图3，泳道1)，回收产物与egf3延伸产物在P1和P3扩增
2.2 克隆载体构建结果
将hegf基因克隆到pMD18-T vector中，并转化大肠杆菌DH5α，经过菌液PCR鉴定和Xho I、Xba I双酶切鉴定(如图4)，得到阳性克隆，并选择一个阳性克隆送至宝生物工程(大连)有限公司进行测序分析，结果显示序列与预定序列一致，
2.3 hegr表达载体构建结果
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