人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达(2)

http://www.100md.com 2007年3月1日 彭仕芳　傅　蕾　谭德明　刘洪波

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    参见附件(646KB，6页)。

     nmol，RNA酶抑制剂25U，MMLV逆转录酶200U，加DEPC水至总体积25μL，42℃60min逆转录；逆转录后产物为cDNA，取cDNA2μL，加入10×PCR Buffer 5μL，dNTP³ 20nmol，sTNFR1上游及下游引物各50pmol，GAPDH上游及下游引物各50pmol，TaqDNA聚合酶3U，加双蒸水至总体积50μL。置PCR仪中，循环温度及时间为：95℃5min；随后以3步循环(94℃40s，55℃40s，72℃1min)扩增DNA，共32个循环；最后72℃10min延伸，反应结束后取PCR产物8μL，1.2%琼脂糖凝胶电泳照相。

    2)对RT-PCR鉴定的5个单克隆细胞株取其中1株作Western-blotting鉴定，并以P/NIH3T3和NIH3T3作对照：将100mL培养瓶中的细胞，用冰预冷PBS洗一次，加入1mL裂解缓冲液，冰浴20min，用细胞刮刮下细胞，将裂解缓冲液及细胞碎片吸入一预冷的EP管中；4℃下10000r/min，离心2min；将上清液吸人一新EP管，保存于-70℃二将蛋白与加样缓冲液1:1比例混合，100℃煮沸5min；10000r/min离心5min；上清用于加样。

    将收集的上清液进行SDS-PAGE电泳分离后，将细胞蛋白转移到PVDF膜上，100V、4℃转移电泳70min，转膜完毕经丽春红染色可见有目的蛋白条带，TBS洗涤两次，用含5%脱脂奶粉的TBST 37℃封闭1h，将PVDF膜与兔抗人sTNFR1多克隆抗体(浓度0.1mg/L)温育2h，TBST洗涤5minx3后。与HRP标记的羊抗兔IgG(1:3000)室温孵育1h，TBS洗涤10min×3，0.1mL/em²量加ECL发光试剂，暗室内曝光X光胶片，常规方法显影、定影。

    2 结果

    2.1 sTNFR1基因片段的扩增及纯化

    经扩增的sTNFR1的基因片段的产物通过1%琼脂糖凝胶电泳可见558bp大小的DNA条带(图1) ......

    http://www.100md.com/html/paper/1007-7847/2007/01/15-1.htm

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