人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达(1)
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参见附件(646KB，6页)。
摘 要：以Hela细胞的总RNA为模板，用RT-PcR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段，构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3.1(一)重组质粒亚克隆，将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系，G418筛选稳定转染细胞株，经核苷酸序列测序和酶切鉴定，成功构建了pcDNA3.1(-)-sTNFR1真核表达质粒，脂质体法建立了高效表达sTNFR1的稳定转染细胞系，并经RT-PCR和Westem Blotting鉴定，人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达，为今后的研究打下了基础。
关键词：人可溶性肿瘤病坏死因子受体1；克隆；真核表达；稳定转染
中图分类号：R575.3
文献标识码：A
文章编号：1007-7847(2007)01-0078-06
肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor，TNFα)是体内重要的免疫调节因子和炎症介质，它的生物学作用通过受体介导，TNFα过量表达与败血症休克、暴发性肝炎、类风湿性关节炎和移植后的排斥反应等疾病的发生有密切相关，而TNFα的可溶性受体(sTNFR1)可中和TNFα的毒性作用，因此sTNFR1有潜在的临床应用价值，本文拟构建sTNFR1的真核表达载体，并在NIH3T3中表达，为下一步sTNFR1用于基因治疗奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种、细胞株与质粒
JM109由我室保存，人Hela细胞株和小鼠成纤维细胞(NIH3T3)由中南大学肿瘤研究所提供，pGEM-T载体购自Promega公司，真核表达质粒pcDNA3.1(-)购自美国Invitrogen公司.
1.1.2 酶及主要试剂
TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、BamH I、EcoR I、DNA回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自TakaRa公司，MMLV逆转录酶购自Promega公司，脂质体转染剂Lipofactamine 2000购自美国Invitrogen公司，TRIzol Reagent RNA分离液、DMEM(高糖)、新生牛血清和G418购自美国GIBCO BRL公司，兔抗人sTNFR1多克隆抗体购自PEPROTECH公司，Western-blotting检测试剂盒购自博士德公司，ECL试剂盒购自Amersham公司，常用试剂为国产或进口分析纯。
1.1.3 引物
GAPDH引物：购自北京鼎国生物公司，上游引物序列：5′ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3′;下游引物序列：5′TCC ACC ACC CTG TTGCTG TA 3′，目的片段452 bp，人sTNFR1扩增用PCR引物参照其cDNA[7]设计，由上海博亚公司合成，上游引物：5′-GAA TCC ATG GAT AGT GTGTGT CCC C-3′;下游引物：5′-GTC GAC GGA TCCTCA AAT GAT CAG GGG CAA C-3′，1.1.4 仪器
核苷酸测序使用AB1377全自动测序仪及配套的BigDye Terminator试剂盒，由博亚公司完成，Tannon Gis凝胶分析系统为上海天能公司产品，
1.2 方法
1.2.1 RT-PCR扩增sTNFR1目的片段
自Hela细胞中提取总RNA作为逆转录模板，采用RT-PCR方法扩增sTNFR1基因，逆转录反应条件参照MMLV逆转酶说明书进行：取总RNA 3μg，Oligo(18)0.5μg，Oligo(18)0.5μg，加DEPC水至总体积12μL，70℃5 min后，立即置于冰上；然后加入5×RT Buffer 5μL，dNTP12.5nmol，RNA酶抑制剂25U，MMLV逆转录酶200U。加DEPC水至总体积25L，42cI=60min逆转录，逆转录后产物为cDNA，PCR反应体系为cDNA 2μL，TaqDNA聚合酶0.5U，10×Buffer(Mg2+)5μL，10mmol/L dNTP3 4μL，人sTNFRl引物各25pmol，加双蒸水至总体积50μL.PCR条件：95℃5min预变性，94℃40s变性，55℃40s退火，72℃1min延伸，32个循环后，72℃延伸15 min.
1.2.2 构建T载体克隆
PCR产物用DNA回收纯化试剂盒回收纯化后与T载体连接，转入感受态大肠杆菌JMl09，经蓝、白筛选，挑选单个阳性克隆，在含有100mg/L氨苄青霉素培养基中过夜生长，提取质粒，用BamH I和EcoR I双酶切鉴定。
1.2.3 构建真核表达载体亚克隆
将T载体克隆酶切后目的片段，质粒pcDNA3.1(-)用BamH I、EcoR I双酶切后经大齿孔电泳，DNA回收纯化试剂盒回收纯化，将纯化后的两基因片段16℃过夜连接，转入感受态细菌JMl09，挑取阳性克隆，接种于含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养过夜生长，提取质粒，BamHI和EcoR I双酶切鉴定，并且核苷酸测序证实。
1.2.4 重组质粒转染NIH3T3细胞及阳性细胞克隆的筛选
在6孔板中接种NIH3T3细胞(每毫升2×105个细胞)，37℃、5%C02的培养箱中培养18～24h，待细胞生长至90%-95%满时分别用重组质粒(pcDNA3.1(-).sTNFRl)和空质粒(pcDNA3.1(-))进行转染，并设阴性对照(仅有培基，不加质粒DNA)，具体操作按脂质体Lipofac-tamine 2000说明书进行，转染后96h，改用选择性培基(G418浓度前两天为250mg/L，后为500mg/L)，隔日换液，一共选择培养16d，至阴性对照孔细胞全部死亡，后降G418浓度为250mg/L，第18d后陆续挑取6个单克隆细胞(分别编号为N1-6)扩大培养.建立稳定传代的转染细胞株pcDNA3.1(-)-sTNFR1/NIH3T3(PSR/NIH3T3)。
1.2.5 重组质粒转染NIH3T3细胞及阳性细胞克隆的鉴定
1)对PSR/NIH3T3 6个细胞系进行RT-PCR分析，pcDNA3.1(-)/NIH3T3(P/NIH3T3)和NIH3T3作对照，筛选sTNFR1 mRNA有表达的真性克隆，细胞RNA的提取步骤同上，在紫外分光光度仪上检测RNA的质量及浓度后进行RT-PCR，取总RNA3 μg，Oligo(18)0.5μg，加DEPC水至总体积12μL，70℃5min后，立即置于冰上；然后加入5×RT Buffer 5μL，dNTP3 12.5
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