定点突变技术研究苏云金杆菌CrY1类晶体蛋白结构与功能的进展(2)
于中肠膜插入，却使毒力下降，离子通道活性的增强使毒素对胰蛋白酶处理更敏感，尤其Asp242～Arg265盐桥，对毒蛋白稳定性作用显著，说明DomainⅡ在离子通道形成，中肠膜插入过程中也起到一定作用，Francis Raiamohan等人突变CrylAb DomainⅡ370～375位残基(FNIGI)，结果N372A和N372G对吉普赛蛾(Gypsy Moth)的LC50值分别为34ng/cm2和35ng/cm2，比野生型毒力提高8倍之多，而与BBMV的结合亲和力比野生型分别提高了4倍，然而去除N372将会大大降低其毒力和亲和力，说明N372在受体结合中起作用，三突变子N372A/A282G/L283S LC50值为8.0 ng/cm2，比野生型毒力提高了36倍，其毒力的提高与高结合亲和力及结合时浓度有关，解离结合实验也表明三突变子毒素结合力比野生型和N372高出4倍之多，除1373A外，其它突变子都对中肠液和胰蛋白酶处理稳定，D2(删除370和375)、F371A和G374A毒力丧失很大，N372A和1375A则只降低2倍，同源、异源竞争结合实验表明，不可逆结合中具有毒力的N372A、1375A只有20%～25%与BBMV解离，而毒力降低的D2、F371A和G374A则50%～55%与BBMV解离，电压钳实验也进一步证明杀虫特异性直接与BBMV的不可逆反应有关，F371A不影响初始结合，但是不可逆结合减少，说明CrylAb DomainⅡ上突变不会影响毒蛋白的整体结合，但会影响不可逆结合，Cristopher Padilla等人实验证明：117、219、226和455位高疏水性残基被Cys替换后影响了晶体的形成，与被Phe替换相比毒力更低，此外219、316、455位氨基酸残基突变影响了与BBMV的结合，Munah Abdul Rauf等人将CrvlC DomainⅡloop2，loop3上残基突变，发现杀虫特异性和初始结合都受到影响，Q374N、P375A、W376Y、P377A对海灰翅夜蛾(5.Littoralis)毒力变化不大，而对埃及伊蚊(A.aegypti)毒力则大大降低，另外这些突变子与受体结合力的差别很大，对于不同靶标昆虫的毒力也不同，以上实验结果表明DomainⅡ主要影响毒蛋白与受体的结合，也在蛋白酶水解，中肠膜插入和杀虫特异性方面起到一定作用，一般来说毒力的改变与受体结合存在一定关系，但也有特例，以上某些位点的突变可以证明这点，毒力的改变并不一定与受体结合成正相关，相对保守的盐桥的突变实验结果也表明DomainⅡ在维持蛋白结构的稳定性和中肠膜插入方面起到重要作用。
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1.3结构域Ⅲ的突变
结构域Ⅲ具有两个反平行的β片层的三明治结构，主要在维持毒蛋白结构的稳定性上起作用，同时还与杀虫特异性有关，在与受体的结合、离子通道的形成、中肠膜插入中也起一定作用，JLSchwaaz等用Ala替换CrylAc DomainⅢ上503～525位的氨基酸残基检测其在毒力和受体结合方面的作用，发现509QNR511、509Q、511R、513Y突变为Ala后毒力及与BBMV的结合亲和力降低，所有突变子在胰蛋白酶或中肠液处理时都能产生稳定的毒素片段，结果表明509Q、511Q、513Y在与受体的初始结合中起作用，Luke Masson等人将CrylAc DomainⅢ上一个高度保守的Arg区域突变，525、527、529、531位Arg突变为Gly或Asp后毒力都下降，在磷脂双层结构实验中，突变子与野生型呈现不同曲线，说明这些保守序列对维持结构的完整性和离子通道形成中发挥作用㈣，突变CrylAa DomainⅢ上胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用位点后发现R543S、R566G、F570S、F576S毒力稍有提高，LD50值分别为3.8、3.2、3.9、1.8 ng，与野生型7.9 ng相比，F576S毒力提高了4倍，R543S、R566G、F570S也都分别提高了2倍，但各突变子对胰蛋白酶处理的敏感性与野生型相似，加入Ser蛋白酶抑制剂后，原毒素还能被中肠液继续降解，说明中肠液中其他蛋白酶被激活而产生了正效应，Cami-10等人证实，杂交体CryAAC(1Ac/1Ac/1Ca)对棉铃虫(M.brassicae)和大菜粉蝶(PieTis brassicae)一龄幼虫毒力与野生型相比有很大提高，但是R423位点对蛋白酶处理很敏感，而杂交体CryAAC R423S毒力大大提高，在中肠液稳定性实验和晶体溶解性实验中，由R423S引起的CryAAC loop卢7/β流动性增强，而使毒力得到提高，说明蛋白酶作用位点的改变有利于毒力的提高，CrylAa DomainⅢblock4 521～527序列为RYRVRIR，是一个富含Arg的高度保守的区域，形成一个带正电的高度疏水表面，它通过侧链和R525形成的氢键和与254位的羰基氧原子而与Domain I发生分子内相互作用，从而起到连接Domain I和DomainⅡ的作用，在这一区域的突变子中，R521H离子通道形成能力大大降低，其它突变子R521K、R521Q、R527K离子通道形成能力也都稍有降低，在磷脂双层结构实验中，R521H、R527K的中肠膜插入能力降低，有趣的是，最保守的R521K和最不保守的R521E对离子通道形成能力的影响相似，而R521H替换则无影响，说明Arg区域突变只是CrylAa通道形成能力的一个小的决定因子，其它因素如残基大小、侧链位置、分子内或分子间相互作用也会产生一系列影响，这些结果表明Domain I和DomainⅢ上Arg的相互作用很大，并且其作用也不仅仅依赖于这些突变的残基。
, 百拇医药
2结语
根据以上实验结果，我们可以得知杀虫晶体蛋白作用机制：
1)毒素是通过先插入由疏水性的α5和两亲性的α4螺旋组成的发夹插入昆虫中肠膜，形成孔道，位于DomainⅢblock4上残基与β17上残基形成的氢键和羰基氧原子，连接了Domain I和DomainⅡ，从而在离子通道形成中发挥作用。
2)DomainⅡ参与受体结合，包括初始结合和不可逆结合，并且在一定程度上影响杀虫特异性，其上的保守区域对维持杀虫晶体蛋白三维结构的稳定性具有一定作用。
3)DomainⅢ上β17在离子通道和插入中肠膜的过程中起作用，由此推断DomainⅢ参与了离子通道形成和插人中肠膜过程。
随着利用定点突变技术对苏云金杆菌研究的深入，对改变其杀虫谱窄，对昆虫致死时间长，诱导昆虫产生抗性的问题将有可能得到解决，很有希望研究开发出高效、广谱、速杀、抗抗性的Bt杀虫剂，本研究室根据突变胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用位点，可以激活中肠液中其他蛋白酶的作用，产生正效应，而选取突变位点，目前已筛选到高毒力的突变菌株，杀虫效果比野生型菌株好，随着对杀虫晶体蛋白结构和作用机理的不断深入研究，通过各种途径改造杀虫晶体蛋白分子结构，构建高效，广谱的工程菌株是完全有可能的。, 百拇医药(张春艳等)
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1.3结构域Ⅲ的突变
结构域Ⅲ具有两个反平行的β片层的三明治结构，主要在维持毒蛋白结构的稳定性上起作用，同时还与杀虫特异性有关，在与受体的结合、离子通道的形成、中肠膜插入中也起一定作用，JLSchwaaz等用Ala替换CrylAc DomainⅢ上503～525位的氨基酸残基检测其在毒力和受体结合方面的作用，发现509QNR511、509Q、511R、513Y突变为Ala后毒力及与BBMV的结合亲和力降低，所有突变子在胰蛋白酶或中肠液处理时都能产生稳定的毒素片段，结果表明509Q、511Q、513Y在与受体的初始结合中起作用，Luke Masson等人将CrylAc DomainⅢ上一个高度保守的Arg区域突变，525、527、529、531位Arg突变为Gly或Asp后毒力都下降，在磷脂双层结构实验中，突变子与野生型呈现不同曲线，说明这些保守序列对维持结构的完整性和离子通道形成中发挥作用㈣，突变CrylAa DomainⅢ上胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用位点后发现R543S、R566G、F570S、F576S毒力稍有提高，LD50值分别为3.8、3.2、3.9、1.8 ng，与野生型7.9 ng相比，F576S毒力提高了4倍，R543S、R566G、F570S也都分别提高了2倍，但各突变子对胰蛋白酶处理的敏感性与野生型相似，加入Ser蛋白酶抑制剂后，原毒素还能被中肠液继续降解，说明中肠液中其他蛋白酶被激活而产生了正效应，Cami-10等人证实，杂交体CryAAC(1Ac/1Ac/1Ca)对棉铃虫(M.brassicae)和大菜粉蝶(PieTis brassicae)一龄幼虫毒力与野生型相比有很大提高，但是R423位点对蛋白酶处理很敏感，而杂交体CryAAC R423S毒力大大提高，在中肠液稳定性实验和晶体溶解性实验中，由R423S引起的CryAAC loop卢7/β流动性增强，而使毒力得到提高，说明蛋白酶作用位点的改变有利于毒力的提高，CrylAa DomainⅢblock4 521～527序列为RYRVRIR，是一个富含Arg的高度保守的区域，形成一个带正电的高度疏水表面，它通过侧链和R525形成的氢键和与254位的羰基氧原子而与Domain I发生分子内相互作用，从而起到连接Domain I和DomainⅡ的作用，在这一区域的突变子中，R521H离子通道形成能力大大降低，其它突变子R521K、R521Q、R527K离子通道形成能力也都稍有降低，在磷脂双层结构实验中，R521H、R527K的中肠膜插入能力降低，有趣的是，最保守的R521K和最不保守的R521E对离子通道形成能力的影响相似，而R521H替换则无影响，说明Arg区域突变只是CrylAa通道形成能力的一个小的决定因子，其它因素如残基大小、侧链位置、分子内或分子间相互作用也会产生一系列影响，这些结果表明Domain I和DomainⅢ上Arg的相互作用很大，并且其作用也不仅仅依赖于这些突变的残基。
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2结语
根据以上实验结果，我们可以得知杀虫晶体蛋白作用机制：
1)毒素是通过先插入由疏水性的α5和两亲性的α4螺旋组成的发夹插入昆虫中肠膜，形成孔道，位于DomainⅢblock4上残基与β17上残基形成的氢键和羰基氧原子，连接了Domain I和DomainⅡ，从而在离子通道形成中发挥作用。
2)DomainⅡ参与受体结合，包括初始结合和不可逆结合，并且在一定程度上影响杀虫特异性，其上的保守区域对维持杀虫晶体蛋白三维结构的稳定性具有一定作用。
3)DomainⅢ上β17在离子通道和插入中肠膜的过程中起作用，由此推断DomainⅢ参与了离子通道形成和插人中肠膜过程。
随着利用定点突变技术对苏云金杆菌研究的深入，对改变其杀虫谱窄，对昆虫致死时间长，诱导昆虫产生抗性的问题将有可能得到解决，很有希望研究开发出高效、广谱、速杀、抗抗性的Bt杀虫剂，本研究室根据突变胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用位点，可以激活中肠液中其他蛋白酶的作用，产生正效应，而选取突变位点，目前已筛选到高毒力的突变菌株，杀虫效果比野生型菌株好，随着对杀虫晶体蛋白结构和作用机理的不断深入研究，通过各种途径改造杀虫晶体蛋白分子结构，构建高效，广谱的工程菌株是完全有可能的。, 百拇医药(张春艳等)