民猪的SLA-DRB基因的PCR-RFLP多态性分析
 |
 |
 |
 |
摘 要：采用克隆测序和PCR-RFLP相结合的方法，对民猪的SLA-DRB基因的整个编码区进行了扫描和多态性分析，结果表明该基因的第2外显于是整个基因的高变区，突变率达到5.6%，其中80%为有效突变，但没有发现新的等位基因；PCR-RFLP结果表明外显子1用内切酶Alu I酶切可获得3种基因型；外显子2用內切酶Taq I酶切可获得3种基因型：外显子3用內切酶Bcn I酶切可获得3种基因型：外显于4用內切酶Mbo I酶切可获得2种基因型：外显子5用内切酶Hinl I酶切可获得3种基因型，Hardy-Weinberg平衡分析表明民猪在Alu I和Hinl I处于平衡状态(P>0.05)，在Taq I、Bcn I和MBoI处于不平衡状态。
关键词：民猪；SLA-DRB；克隆；PCR-RFLP
中图分类号：S813.3 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2007)04-0373-04
, 百拇医药 LA由I类、Ⅱ类和Ⅲ类3个基因簇组成，其中Ⅱ类基因控制机体免疫应答，与猪的抗病能力密切相关，Ⅱ类基因又分为A基因和B基因，分别产生α肽链和卢肽链，在卢链的结构域内部存在多处抗原肽结合位点，研究DRB基因的多态性，对搞清Ⅱ类抗原分子β结构域在外源性抗原递呈中所起的作用以及结构域内部结构的变化对功能的影响有着重要的参考意义；同时，由于Ⅱ类基因和机体的抗病力密切相关，故研究其编码区的多态性对研究猪的抗病能力以及抗病育种将具有重要的参考意义，目前关于SLA-DRO基因的研究全部集中在第2外显子上，对其他外显子的研究甚少，本研究欲对其整个编码区进行全面的分析研究，通过克隆测序找到突变位点，并选择合适的内切酶进行PCR-RFLP分析。
1 材料与方法
1.1 实验材料
东北民猪60头来自兰西种猪场。
1.2 实验方法
, 百拇医药
1.2.1 PCR扩增用引物及PCR反应的退火温度见表1。
1.2.2 主要仪器及试剂
2720 Thermal Cycler PCR仪；Alu I、Taq I、Bcn I、Mbo I、HiM I限制性内切酶(TakaRa)；T载体(TakaRa)，胶回收试剂盒(华舜)，质粒提取试剂盒(华舜)。
1.2.3 实验内容
PCR扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳检测无杂带后，用胶回收试剂盒回收目的带，连接入T载体，转化人大肠杆菌(JM109)感受态，37℃培养过夜，挑取阳性菌落，摇菌，提质粒，BamH I和HindⅢ双酶切鉴定后，寄往上海生工测序，测序结果用Primer Premier 5.0软件进行比对分析；对发现的酶切位点采用PCR-RFLP进行检测；酶切体系：内切酶10U，PCR产物8μL，37℃酶切过夜。
, 百拇医药
1.2.4 序列分析与数据处理
用DNAMAN软件进行同源性比对；用PrimerS，0软件进行酶切位点分析。
2 结果与分析
2.1 克隆测序结果
本实验共获得了民猪的6条SLA-DRB基因的全长cDNA序列，将这6条序列进行比对后发现突变大多集中在第2外显子处，其他3个外显子突变较少(表2)，与NCBI网上提供的SLA，DRB基因序列相比较，没有发现新的等位基因。
2.2 PCR-RFLP分型结果
外显子1经内切酶ALu I酶切后，得到3种RFLP带型，190 bp(AA)、190 bp/72 bp/118 bp(AB)、72 bp/118 bp(BB)；外显子2经内切酶JP：aq I酶切后，得到3种RFLP带型，274 bp(AA)、274 bp/35 bp/239 bp(AB)、35 bp/239 bp(BB)，BB型中的35 bp由于片段过小，在琼脂糖上检测不到；外显子3经限制酶Bcn I酶切后，得到3种RFLP带型，248 bp(AA)、248 bp/112 bp/136 bp(AB)、112 bp/136 bp(BB)；外显子4经限制酶Mbo I酶切后，得到2种带型，无AB型，255bp(AA)、121 bp/134 bp(AB)；外显子5经限制酶Hinl I酶切后，得到3种RFLP带型，281 bp(AA)、281 bp/161 bp/120 bp(AB)、161 bp/120bp(BB)。
, 百拇医药
2.3 统计分析
多态位点的各参数值及x2适合性检验值见表3。
SLA-DRB基因在第2、3、4、5外显子处的杂合度值接近0.5，表明这4个位点属于多态位点，x2适合性检验结果表明民猪在Alu I和Hinl I位点的3种基因型分布处于遗传平衡状态，而在其他3个基因位点的基因型分布都显著或极显著偏离Hardy-Weinberg定律。
3 讨论
猪的主要组织相容性复合体(major histocom-patibility complex，MHC)又称猪的白细胞抗原(swine lymphocyte antigen，SLA)，由Vaiman等和Viza等于1970年首次发现，Shia Y C等通过PCR-RFLP分析，将SLA-DRB的PCR产物用限制酶Msp I和Rsa I酶切后共分出了7种等位基因型；Komatsu等(2000)使用RT-PCR-RFLP方法对SLA-DRB进行了分型研究，在中国香猪和梅山猪中发现了新的等位基因的RFLP片段，并将当时所发现的55个SLA-DRB等位基因分为22组RFLP带型(用限制酶Rsa I和Msp I酶切)；谈永松等(2005)采用PCR-RFLP和PCR-SSCP技术对SLA，DRB基因的外显子2进行了多态性分析，用限制酶Msp I酶切出1种RFLP带，用Rsa 1分出4种RFLP带，采用PCR-SSCP技术共分出7种标记带型。
, 百拇医药
通过前人的研究结果可知，关于SLA，DRB基因的研究大都集中在第2外显子处的MspI和Rsa I上，对其余4个外显子均没有研究，这是由于第2外显子所处的重要位置及其高变性所决定的，本实验通过对SLA-DRB基因整个编码区的克隆测序，检测了该基因的整体突变情况，在所检测的6个个体中，共发现了26个点突变，其中80%为有效突变，突变点大多集中在第2外显子处，这与前人的研究结果基本一致，但没有发现新的点突变，截至到2006年10月，在NCBI网上，关于SLA-DRB这一个基因所提交的序列就已经达到了45个，可见它是一个突变率非常高的基因，对这26个点突变中的5个点突变进行了PCR，RFLP分析，结果发现，除了MBo I酶切位点处不存在AB型个体外，其余4个酶切位点均存在3种基因型，但不同位点处的平衡状态不同。本研究结果为进行准确而全面的分子生物学分型，以及探讨不同基因型对猪的抗病力的影响奠定了一定的基础。
作者简介：张冬杰(1980—)，女，黑龙江哈尔滨人，博士研究生，主要从事动物分子遗传学研究；刘娣(Ⅱ963一)，女，吉林长春人，东北农业大学教授，博士，通讯作者，主要从事动物遗传育种与繁殖的研究。, 百拇医药(张冬杰 杨国伟 刘 娣)