pIRES2—NGF—NT—3真核表达载体的构建与鉴定(1)
摘要：构建双基因共表达载体pIRES2-NGF-NT-3并检测其在HEK293细胞中的表达。人神经生长因子(nerve growth factor， NGF)和神经营养素3(neurotrophin-3，NT-3)是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取，将人神经生长因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-NGF-EGFP神经营养素3cDNA片段通过替换绿色荧光蛋白基因(EGFP)的方式插入到pIRES2-NGF-EGFP中构建成为pIRES2-NGF-NT-3双基因共表达载体，将pIRES2-NGF-NT-3用脂质体转染HEK293细胞并采用RT-PCR与Western-blot的方法检测其表达。人神经生长因子和神经营养素3被克隆，通过测序和酶切鉴定的得知与基因库报道序列一致。pIRES2-NGF-NT-3转染HEK293细胞后双基因在mRNA和蛋白水平均得到了表达。人神经生长因子和神经营养素3双基因真核表达载体成功构建，它提供了一个新的表达系统，为进一步研究双基因的功能奠定了基础。
关键词：人神经生长因子；神经营养素3；真核双表达裁体；内部核糖体进入位点
中图分类号：Q812
文献标识码：A
文章编号：1007-7847(2014)04-0315-08
外伤性脊髓损伤发生率比较高，一般都会导致严重的神经系统损害。中枢神经系统损伤的恢复是相当困难的，因为受伤的中枢神经系统，其细胞与髓鞘再生以及重建功能性神经连接的能力有限。随着干细胞技术的发展，增加轴突再生的治疗策略之一——干细胞向受损脊髓部位的移植研究越来越广泛。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)被认为是一个很好来源的干细胞，由于巨大的自我更新和多谱系分化潜能。使用间充质干细胞治疗缺血性脑损伤的动物实验中，其疗效已经得到证实。人类骨髓细胞在治疗血液病方面有着悠久的历史。此外，非造血干细胞，如骨髓间充质干细胞(MSCs)，却可以分化成成熟的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。研究发现，骨髓细胞(骨髓间充质干细胞)在特定的实验条件下可以诱导分化为成熟的神经元或神经胶质细胞。这些发现为骨髓间充质干细胞应用于神经性疾病患者的治疗增加了可能性，这也避免了使用胚胎干细胞而带来的伦理问题。
在组织工程研究中，采用基因修饰的方法来提高干细胞的增值和定向分化的能力一直是研究的热点领域。神经生长因子、神经营养因子-3脑源性神经营养因子或衍生的支架或在这些因素的基础上构建的表达载体在动物实验研究中得到了广泛的使用，并逐渐应用于临床研究。本研究旨在通过一种简单和有效的方法构建一个双基因的真核表达载体pIRES2-NGF-NT-3，为进一步研究NGF (nerve growth factor)与NT-3 (neu-rotrophin-3)这两个基因的协同功能奠定基础。
1材料与方法
1.1实验材料
pIRES2-EGFP购自北京天恩泽基因科技有限公司(中国)；人外周血单个核细胞取自健康捐献者，已签署知情同意书；E.coli菌株DH5α、HEK293T细胞株为本实验室保存；T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、Xho I、BamH I、Not I、BstX I限制性内切酶、总RNA的提取试剂盒、逆转录试剂盒、高纯度凝胶提取试剂盒、DNA marker均购自购自宝生物工程大连有限公司(中国)；Tri-zol Reagent和转染试剂脂质体2000购自Invitro-gen公司(美国)；DMEM培养基与新生牛血清、胰蛋白酶为购自Gibco公司(美国)；质粒小提试剂盒购自Sangon公司(中国)；NGF与NT-3抗体一抗购Santa Cruz公司(美国)；引物由上海生物工程技术服务有限公司合成(中国)。
1.2引物的设计与合成
NGF(NM_002506.2)和NT-3(NM_0011026-54.1)在基因库中的基因序列用来作为模板设计引物(见表1)。人神经生长因子(NGF基因片段的核心编码序列完全的基因组DNA的外显子3上。两条特异性的引物被设计用于从外显子3上扩增出人神经生长因子。Xho I限制性内切酶切割位点和保护性碱基添加在上游引物，在下游引物中加入BamH I限制性内切酶切割位点和保护性碱基，扩增片段长度为726bp。接着设计了两对引物来扩增人类神经营养因子3。长的正向引物在5'末端比短的正向引物多出来4个碱基。与此类似，反向长引物序列比反向短引物序列也多出来4个碱基，我们通过双PCR的方法在正向引物序列中引入了BstX I粘性末端一部分，而在反向引物序列中引入了Not I粘性末端一部分，这将用于组装BstX I位和Not I粘性末端，扩增片段长度为774bp。
1.3 pIRES2-NGF-EGFP表达载体的构建
人外周血单核细胞的基因组DNA为模板，采用神经生长因子特异性引物用于扩增NGF基因。人神经生长因子基因片段的核心编码序列是完全位于基因组DNA的第3个外显子上。采用20μL PCR反应体系，包括基因组DNAO.5μL(10ng)， 2xPrimeSTARMaxDNAPolymerase 10μL，无RNase水7.5μL，上游引物和下游引物各1μL。反应条件为：95℃ 5min，98℃ 10s，55℃，5s，72℃ 50s，30循环，最后，72℃，保持5min。用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，然后将PCR产物和pIRES2-EGFP质粒用Xho I和BamH I限制性内切酶双酶切。酶切后的PCR产物用PCR纯化试剂盒纯化。通过T4 DNA连接酶将该DNA片段插入到质粒中。连接体系为20μL，包括质粒pIRES2-EGFP 2μL，cDNA(神经生长因子)8μL，T4 DNA连接酶0.2μL，其余添加灭菌水至20μL。在22℃水浴中连接30min。将连接后的片段转化入DH5α中，然后平铺入含有卡那抗性的LB培养板中37℃培养16h。第二天挑取阳性菌落进行接种，在37℃、225r/min摇床中进行培养12～16h，然后提取质粒后酶切鉴定，即可得到重组pIRES2-NGF-EGFP质粒。, 百拇医药(栗炳南 李卫东 林俊堂 丰慧根 原志庆)
关键词：人神经生长因子；神经营养素3；真核双表达裁体；内部核糖体进入位点
中图分类号：Q812
文献标识码：A
文章编号：1007-7847(2014)04-0315-08
外伤性脊髓损伤发生率比较高，一般都会导致严重的神经系统损害。中枢神经系统损伤的恢复是相当困难的，因为受伤的中枢神经系统，其细胞与髓鞘再生以及重建功能性神经连接的能力有限。随着干细胞技术的发展，增加轴突再生的治疗策略之一——干细胞向受损脊髓部位的移植研究越来越广泛。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)被认为是一个很好来源的干细胞，由于巨大的自我更新和多谱系分化潜能。使用间充质干细胞治疗缺血性脑损伤的动物实验中，其疗效已经得到证实。人类骨髓细胞在治疗血液病方面有着悠久的历史。此外，非造血干细胞，如骨髓间充质干细胞(MSCs)，却可以分化成成熟的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。研究发现，骨髓细胞(骨髓间充质干细胞)在特定的实验条件下可以诱导分化为成熟的神经元或神经胶质细胞。这些发现为骨髓间充质干细胞应用于神经性疾病患者的治疗增加了可能性，这也避免了使用胚胎干细胞而带来的伦理问题。
在组织工程研究中，采用基因修饰的方法来提高干细胞的增值和定向分化的能力一直是研究的热点领域。神经生长因子、神经营养因子-3脑源性神经营养因子或衍生的支架或在这些因素的基础上构建的表达载体在动物实验研究中得到了广泛的使用，并逐渐应用于临床研究。本研究旨在通过一种简单和有效的方法构建一个双基因的真核表达载体pIRES2-NGF-NT-3，为进一步研究NGF (nerve growth factor)与NT-3 (neu-rotrophin-3)这两个基因的协同功能奠定基础。
1材料与方法
1.1实验材料
pIRES2-EGFP购自北京天恩泽基因科技有限公司(中国)；人外周血单个核细胞取自健康捐献者，已签署知情同意书；E.coli菌株DH5α、HEK293T细胞株为本实验室保存；T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶、Xho I、BamH I、Not I、BstX I限制性内切酶、总RNA的提取试剂盒、逆转录试剂盒、高纯度凝胶提取试剂盒、DNA marker均购自购自宝生物工程大连有限公司(中国)；Tri-zol Reagent和转染试剂脂质体2000购自Invitro-gen公司(美国)；DMEM培养基与新生牛血清、胰蛋白酶为购自Gibco公司(美国)；质粒小提试剂盒购自Sangon公司(中国)；NGF与NT-3抗体一抗购Santa Cruz公司(美国)；引物由上海生物工程技术服务有限公司合成(中国)。
1.2引物的设计与合成
NGF(NM_002506.2)和NT-3(NM_0011026-54.1)在基因库中的基因序列用来作为模板设计引物(见表1)。人神经生长因子(NGF基因片段的核心编码序列完全的基因组DNA的外显子3上。两条特异性的引物被设计用于从外显子3上扩增出人神经生长因子。Xho I限制性内切酶切割位点和保护性碱基添加在上游引物，在下游引物中加入BamH I限制性内切酶切割位点和保护性碱基，扩增片段长度为726bp。接着设计了两对引物来扩增人类神经营养因子3。长的正向引物在5'末端比短的正向引物多出来4个碱基。与此类似，反向长引物序列比反向短引物序列也多出来4个碱基，我们通过双PCR的方法在正向引物序列中引入了BstX I粘性末端一部分，而在反向引物序列中引入了Not I粘性末端一部分，这将用于组装BstX I位和Not I粘性末端，扩增片段长度为774bp。
1.3 pIRES2-NGF-EGFP表达载体的构建
人外周血单核细胞的基因组DNA为模板，采用神经生长因子特异性引物用于扩增NGF基因。人神经生长因子基因片段的核心编码序列是完全位于基因组DNA的第3个外显子上。采用20μL PCR反应体系，包括基因组DNAO.5μL(10ng)， 2xPrimeSTARMaxDNAPolymerase 10μL，无RNase水7.5μL，上游引物和下游引物各1μL。反应条件为：95℃ 5min，98℃ 10s，55℃，5s，72℃ 50s，30循环，最后，72℃，保持5min。用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，然后将PCR产物和pIRES2-EGFP质粒用Xho I和BamH I限制性内切酶双酶切。酶切后的PCR产物用PCR纯化试剂盒纯化。通过T4 DNA连接酶将该DNA片段插入到质粒中。连接体系为20μL，包括质粒pIRES2-EGFP 2μL，cDNA(神经生长因子)8μL，T4 DNA连接酶0.2μL，其余添加灭菌水至20μL。在22℃水浴中连接30min。将连接后的片段转化入DH5α中，然后平铺入含有卡那抗性的LB培养板中37℃培养16h。第二天挑取阳性菌落进行接种，在37℃、225r/min摇床中进行培养12～16h，然后提取质粒后酶切鉴定，即可得到重组pIRES2-NGF-EGFP质粒。, 百拇医药(栗炳南 李卫东 林俊堂 丰慧根 原志庆)