1.2.4 巨噬细胞系RAW264.7培养和细胞计数

    无菌条件下将细胞瓶内小鼠巨噬细胞经2.5%胰酶消化后，转移至6孔板中，孔内细胞培养液加至4mL，放人细胞培养箱，5% C02、37℃，24 h半量换液，培养2 d，备用。取六孔板中1孔，用300 μL 2.5%胰酶消化2 min，加1 mL培养液，用吸管吹打至完伞脱落，收集至1.5 mL离心管，2 000r/min离心2min，弃上清，加入lmL PBS，取10 μL至另一含90 μL PBS的1.5 mL离心管，稀释混匀，取10μL悬液滴在计数板上，细胞计数。1.2.5 布鲁氏茵16M和M5侵染小鼠巨噬细胞和菌液计数

    取lμL经计数的菌液于50 mL离心管中，3 min 12 000 r/min，PBS洗3次，然后加19 mL无双抗、含10%胎牛血清的新鲜细胞培养液，重悬。按照布鲁氏菌与RAW 264.7的比例为100：1，麦氏比浊至所需浓度，稀释至1 mL重悬细菌液。弃去六孔板中旧完全培养基，加入重悬细菌液，放入细胞培养箱，5%CO2、37 ℃条件下分别培养5、10、20、30 min、I、1.5、2、2.5、6、12、24、48 h取出六孔板，PBS洗3遍，加入2 mL含20/c双抗、10%胎牛血清的新鲜细胞培养液，备用。

    1.2.6 布鲁氏菌16M和M5的胞内存活实验

    RAW 264.7传代至六孔板 ......