1.2.4 cDNA第一链合成

    根据Promega公司的操作说明书，1μL OligodT (0.5 μg/μL)和2.0 μg Total RNA加入PCR管，补充DFPC-H20至9μL。混匀后离心，70℃温浴10 min，在0 ℃冰浴中与模板退火。之后，用5xRT buffer 4μL、10 mmol/L dNTPs 2μL、RNasin0.5 μL、AMV-Rtase lμL、DEPC H20 3.5 μL，混匀后42 ℃水浴2min，再加入M-MLV逆转录酶2 μL， 42℃孵育l h完成RT，70 ℃处理10 min使RT酶失活，得到的RT反应产物cDNA，可立即用于PCR，或保存在-80 ℃下备用。

    1.2.5 目标基因荧光定量

    使用荧光标记PCR方法，荧光染料为SYBRCreen I，罗氏480荧光实时定量PCR仪，3次重复，采用20 μL反应体系：模板1μL，上下游引物各0.5μL， Q-PCR Enhancer 5μL，2xSYBRSYBR Green I 10 μL， DEPC-H20 3μL。PCR反应程序采用二步法：95℃预变性5 min，95℃变性5 s，60℃退火30 s，45个循环，每次在延伸阶段读取吸光值；在PCR反应完成后做熔解曲线分析，方法是在95℃变性l min，冷却至65 ℃，然后从65℃到95℃，每秒增加0.1℃，同时读取吸光值。

    1.2.6 计算方法

    qRT-PCR结果的比较有不同层次 ......