CAT为报告基因的铜绿假单胞菌启动子文库的建立及初步鉴定(2)
1.2.4铜绿假单胞菌基因组文库的构建与鉴定将含有质粒pCAT2的大肠杆菌DH5a接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，按照质粒提取试剂盒提取质粒。pCAT2载体用BglⅡ酶切、去磷酸化，凝胶回收。采用T4 DNA连接酶将去磷酸化的载体与绿脓杆菌基因组随机片段按摩尔比为1：5的比例16 ℃过夜连接，连接产物转化到DH5α感受态中，涂布于Kan+抗性平板筛选，计数平板上的菌落。随机挑选16个菌落，以引物2和引物3进行菌落PCR扩增DNA片段，鉴定插入片段的随机性。PCR反应参数：94℃预变性15 min；94℃变性30 s；50℃复性30 s、72 ℃延伸90 s，循环35次；72 ℃总延伸I0 min。将PCR产物在含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像仪分析系统分析处理。
1.2.5 启动子文库的构建与筛选
收集上述平板上所有菌落于含有LB培养基的无菌EP管中，按质粒小量抽提试剂盒说明书提取质粒DNA，得到含铜绿假单胞菌基因组DNA随机片段的质粒库，即为启动子文库。然后将混合质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，同时以没有插入制绿假单胞菌基因组DNA随机片段的空载体质粒为对照。卡那霉素(50μg/mL)和氯霉素(10μg/mL)双抗平板筛选具有启动子活性的阳性菌株 ......
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