本文以α-芋螺毒素基因内含子3'末端保守序列为PCR的上游引物，以α-芋螺毒素基因的3'非翻译区为下游引物，采用了11个PCR退火温度，克隆到这两个新基因。系列退火温度范围为46℃～56 0C，包括46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃， 53℃，54℃，55℃和56℃。研究发现，只有退火温度在48℃下的PCR产物条带稍大，而且转化后阳性克隆验证时，其条带明显比其他条带要大，测序结果发现克隆到的是属于M-超家族的新芋螺毒素LvⅢ-M01。可见α-芋螺毒素保守内含子可能也存在于其他超家族基因中，而低温度退火有利于长片段的克隆。本文得到的LvXXⅦ-M02是在退火温度52℃发现的，而且其与α-芋螺毒素Ca1.6h基因序列仅有一个碱基的差别，该差别使得LvXXⅦ-M02增加了一个半胱氨酸。从上述分析可以看出，是α-芋螺毒素Ca1.6b的Tyr密码子的点突变而产生的基因突变产物，发生在Cys残基上的突变，对毒素结构和功能的改变影响是深远的，与原祖先毒素肽大相径庭。我们经过多次PCR重复测序，LvⅢ-M01和LvXXⅦ-M02的基因序列都是一致的，排除了PCR扩增突变的可能性。此外，本实验所用疣缟芋螺来源于海南岛海域。来自不同海域的芋螺，即使是同种芋螺也可能由于环境不同而表达不同的毒素[28]，更甚取自相同海域的同种芋螺不同个体之间也存在较大的种内等位基因的差异[29，30]，这也是新芋螺毒素基因产生的重要来源之一。该研究利用具有保守性的α-芋螺毒素基因内含子序列，从海南产疣缟芋螺中克隆到了1个新的具有6个半胱氨酸骨架的M-超家族芋螺毒素LvⅢ-M01基因和1个含有5个半胱氨酸新颖骨架的未知新家族芋螺毒素LvXXⅦ-M02，并对它们的基因结构、成熟肽序列、以及LvⅢ-M01与其他M-超家族芋螺毒素的遗传进化关系进行了深入分析。

    为了深入研究LvⅢ-M01的分类地位及其遗传进化关系，我们基于Conosever数据库构建了M-超家族芋螺毒素成熟肽区半胱氨酸环(CCX2-7CX2-9CX1-5CC)内的进化树，从而发现了3个Loop区氨基酸的保守性，并据此分为Ma、Mb、Mc3个进化枝支。之前的研究也有将O-超家族芋螺毒素分为01、02、03[9]，I-超家族分为I1、I2、I3[31]，但它们都是依据信号肽的保守性来进行分类的，与真正起活性的成熟肽序列之间没有太多的联系 ......