分别对质粒pGEX-4T-l(实验室保存)和pMD19-GrMK进行双酶切、连接，获得原核表达载体pGEX-4T-l-GrMK。使用热激法将重组质粒pGEX-4T—l—GrMK转化大肠杆菌Rosetta( DE3)感受态细胞(Transgene，北京)后，挑取单菌落接种于3 m_L含100 mg/L氨苄青霉素LB液体培养基中，37 0C、250 r/min培养12 h。然后以1：100比例转接到无抗生素的LB液体培养基中，37 0C、250 r/min培养3h至A600≈0.8，在37 °C、终浓度为1 mmol/L IPTG诱导下进行表达，同时以相同条件的pGEX-4T-l转化菌作为对照。分别诱导Oh、2h、4h和6h后收集菌液2 mL。4 °C、8 000 r/min离心1 min，弃上清，加入100 yLddH20、25 yL的5xSDS-PAGE上样缓冲液，震荡悬菌，沸水煮5 min。4 °C、13 000 r/min离心5min。取20μL上清上样 ......