雌核发育抗病草鱼与普通草鱼的免疫学指标比较(1)
摘要：雌核发育抗病草鱼在养殖过程中已表现出较好的抗病能力，但对其抗病力的确定还缺乏有力的证据。通过对雌核发育抗病草鱼和相同饲养条件下普通草鱼的主要免疫球蛋白基因(lgD、IgZ和IgM)相对表达量、免疫生化指标(白蛋白、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶和肌酐)、血清溶茵酶活性等相关参数的比较，分析了雌核发育抗病草鱼的免疫能力。数据显示雌核发育抗病草鱼IgZ、IgM mRNA在血液和脾脏中的相对表达量、IgD mRWA在头肾和脾脏中的相对表达量都与普通草鱼存在显著差异(P<0.05)；溶菌酶活性与普通草鱼存在显著差异(P<0.05)。在免疫生化指标方面，雌核发育抗病草鱼也明显优于普通草鱼。研究结果肯定了雌核发育抗病草鱼在免疫机能方面的优越性。
关键词：雌核发育草鱼；免疫；免疫球蛋白(Ig)；溶菌酶
中图分类号：Q955 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2015)03-0213-05
草鱼(Ctenopharyngodon， idellus)是我国“四大家鱼”之一，它具有生长速度快、肉质好、容易养殖等特点，因其饲料来源广，故极适合在广大农村养殖[1]。但是草鱼抗病能力较差，特别是在一龄、二龄阶段。据统计：在全国范围内，当年鱼苗养殖平均成活率不超过50%，而二龄草鱼养殖发病率又很高，常给养殖户带来重大的经济损失。虽然多年来科技工作者一直致力于草鱼疾病预防与治疗的研究，但因其抗病力差，并未从根本上解决草鱼养殖中病害多、死亡率高的难题。湖南师范大学鱼类发育生物学团队在四倍体鲤鲫[2]的研制基础上开展了雌核发育抗病草鱼[3，4]的培育和育种研究，从目前江苏省实际养殖情况分析，与普通草鱼相比，雌核发育抗病草鱼养殖成活率提高50%，生长速度快10%～15%。
国内学者对于草鱼抗病方面的研究已经有了较多的报道。李耀国等[5]和苏建明等[6]做了关于转基因抗病草鱼研究进展的报道。黄贝等[7]对斜带石斑鱼(Einephelus coioides)IgM、IgZ和IgD蛋白重链基因的克隆进行了探究。关于雌核发育抗病草鱼多方面免疫机能与普通草鱼比较的报道尚属罕见。此外，对于培育的各种抗病鱼类，目前还缺少一个全面、准确的免疫性能评估体系。本文从免疫球蛋白基因相对表达量、免疫生化指标和血清溶菌酶活性等方面对抗病草鱼的免疫性能进行了较为全面的研究，并与同等条件下的普通草鱼进行了分析对比，发现了雌核发育抗病草鱼在免疫机能方面的优越性。研究结果可为该品种后期的推广养殖提供支撑材料，同时也为其他经济鱼类的抗病育种提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物
试验用雌核发育抗病草鱼与普通草鱼均来自江苏省阳澄湖养殖基地，雌核发育草鱼与普通草鱼各3组，每组选取体质健康，规格整齐的草鱼6尾。
1.2试验方法
1.2.1 总RNA的提取和cDNA的合成
活体解剖取出头肾和脾脏等组织，在用二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理水配制的磷酸缓冲液(PH 7.4)中漂洗，经过液氮冷冻后，放于-80 0C保存，用于总RNA的提取。血液的采集通过已加入灭菌抗凝剂的注射器从尾静脉抽取，于4 0C 10 000 r/min离心10 min后收集血细胞，经过液氮冷冻后，放于-80 0C保存。
用RNAiso Plus (Takara)提取各组织的总RNA，用DNA酶(Dnase I Rnase Free，Takara)消化后，溶于20 μL RNase-free的水中，经紫外分光光度计检测RNA的浓度、1010的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性后，取3μg总RNA按照Prime-ScriptⅢlst Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)说明书合成cDNA第一链，-20 0C保存备用。
1.2.2引物设计
根据NCBI上已收录的草鱼免疫球蛋白基因IgD( GQ429174.1)、IgZ( GQ201421.1)和IgM(DQ-417927.1)，用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR引物，如表1所示。
1.2.3 Real-time荧光定量PCR分析
将各组织和血液的cDNA模板进行梯度稀释，用草鱼免疫球蛋白基因引物和β-actin引物，以SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa， Dalian， China)试剂盒提供的试剂在Bio-Rad CFX96 Real-timePCR System上进行定量PCR。反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq'nvi 10μL，荧光定量PCR引物(2μLmol/L)各1.6μL，cDNA模板2μL，灭菌蒸馏水4.8μL。反应程序为95 °C 10 s；95 °C 5 s.60 °C 30 s，40个循环；每次反应都通过从95 °C降至60 °C(每10 s降0.5℃)绘出溶解曲线。每次反应都以无菌水作为空白对照。
结果计算采用LIVAK等[8]的2-A△Ct方法进行，目的基因mRNA的表达量经与卢-actin，比较后，再与对照样品进行相对定量。所得数据以平均值±标准误(x±sx)表示，用GraphPad 5.0绘制草鱼免疫球蛋白各基因相对表达量直方图。
1.2.4血清溶茵酶活性差异
1.2.4.1血清的制备
分别对雌核发育抗病草鱼和普通草鱼进行尾静脉采血，4 0C 3 500 r/min离心15 min，收集血清保存于-80 0C待测。
1 .2.4.2血清溶菌酶活性的测定
采用溶菌酶检测试剂盒(南京建成科技公司)进行溶菌酶活性的测定。将配好的应用菌液、标准品液及所需检测的样本均放人37 °C水浴箱中预温5 min以上，使菌液、标准液及检测样本的温度达37℃。在波长530 nm处，1 cm光径比色皿，以双蒸水调透光度100010后，往相应编号的试管中加入200 μL待测样本或标准品，取2 mL应用菌液迅速冲入试管中，立即混匀，开始计时。之后将其迅速倒人比色皿中，在530 nm处比色，在Ss和2 min 5 s时分别读取透光值。按下式计算溶菌酶含量：, 百拇医药(刘堃 陈剑 陈胜峰 吴萍 丁磊 罗凯坤 毛觉生 王国清)
关键词：雌核发育草鱼；免疫；免疫球蛋白(Ig)；溶菌酶
中图分类号：Q955 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2015)03-0213-05
草鱼(Ctenopharyngodon， idellus)是我国“四大家鱼”之一，它具有生长速度快、肉质好、容易养殖等特点，因其饲料来源广，故极适合在广大农村养殖[1]。但是草鱼抗病能力较差，特别是在一龄、二龄阶段。据统计：在全国范围内，当年鱼苗养殖平均成活率不超过50%，而二龄草鱼养殖发病率又很高，常给养殖户带来重大的经济损失。虽然多年来科技工作者一直致力于草鱼疾病预防与治疗的研究，但因其抗病力差，并未从根本上解决草鱼养殖中病害多、死亡率高的难题。湖南师范大学鱼类发育生物学团队在四倍体鲤鲫[2]的研制基础上开展了雌核发育抗病草鱼[3，4]的培育和育种研究，从目前江苏省实际养殖情况分析，与普通草鱼相比，雌核发育抗病草鱼养殖成活率提高50%，生长速度快10%～15%。
国内学者对于草鱼抗病方面的研究已经有了较多的报道。李耀国等[5]和苏建明等[6]做了关于转基因抗病草鱼研究进展的报道。黄贝等[7]对斜带石斑鱼(Einephelus coioides)IgM、IgZ和IgD蛋白重链基因的克隆进行了探究。关于雌核发育抗病草鱼多方面免疫机能与普通草鱼比较的报道尚属罕见。此外，对于培育的各种抗病鱼类，目前还缺少一个全面、准确的免疫性能评估体系。本文从免疫球蛋白基因相对表达量、免疫生化指标和血清溶菌酶活性等方面对抗病草鱼的免疫性能进行了较为全面的研究，并与同等条件下的普通草鱼进行了分析对比，发现了雌核发育抗病草鱼在免疫机能方面的优越性。研究结果可为该品种后期的推广养殖提供支撑材料，同时也为其他经济鱼类的抗病育种提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验动物
试验用雌核发育抗病草鱼与普通草鱼均来自江苏省阳澄湖养殖基地，雌核发育草鱼与普通草鱼各3组，每组选取体质健康，规格整齐的草鱼6尾。
1.2试验方法
1.2.1 总RNA的提取和cDNA的合成
活体解剖取出头肾和脾脏等组织，在用二乙基焦碳酸酯(DEPC)处理水配制的磷酸缓冲液(PH 7.4)中漂洗，经过液氮冷冻后，放于-80 0C保存，用于总RNA的提取。血液的采集通过已加入灭菌抗凝剂的注射器从尾静脉抽取，于4 0C 10 000 r/min离心10 min后收集血细胞，经过液氮冷冻后，放于-80 0C保存。
用RNAiso Plus (Takara)提取各组织的总RNA，用DNA酶(Dnase I Rnase Free，Takara)消化后，溶于20 μL RNase-free的水中，经紫外分光光度计检测RNA的浓度、1010的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性后，取3μg总RNA按照Prime-ScriptⅢlst Strand cDNA Synthesis Kit (Takara)说明书合成cDNA第一链，-20 0C保存备用。
1.2.2引物设计
根据NCBI上已收录的草鱼免疫球蛋白基因IgD( GQ429174.1)、IgZ( GQ201421.1)和IgM(DQ-417927.1)，用Primer Premier 5.0设计荧光定量PCR引物，如表1所示。
1.2.3 Real-time荧光定量PCR分析
将各组织和血液的cDNA模板进行梯度稀释，用草鱼免疫球蛋白基因引物和β-actin引物，以SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa， Dalian， China)试剂盒提供的试剂在Bio-Rad CFX96 Real-timePCR System上进行定量PCR。反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq'nvi 10μL，荧光定量PCR引物(2μLmol/L)各1.6μL，cDNA模板2μL，灭菌蒸馏水4.8μL。反应程序为95 °C 10 s；95 °C 5 s.60 °C 30 s，40个循环；每次反应都通过从95 °C降至60 °C(每10 s降0.5℃)绘出溶解曲线。每次反应都以无菌水作为空白对照。
结果计算采用LIVAK等[8]的2-A△Ct方法进行，目的基因mRNA的表达量经与卢-actin，比较后，再与对照样品进行相对定量。所得数据以平均值±标准误(x±sx)表示，用GraphPad 5.0绘制草鱼免疫球蛋白各基因相对表达量直方图。
1.2.4血清溶茵酶活性差异
1.2.4.1血清的制备
分别对雌核发育抗病草鱼和普通草鱼进行尾静脉采血，4 0C 3 500 r/min离心15 min，收集血清保存于-80 0C待测。
1 .2.4.2血清溶菌酶活性的测定
采用溶菌酶检测试剂盒(南京建成科技公司)进行溶菌酶活性的测定。将配好的应用菌液、标准品液及所需检测的样本均放人37 °C水浴箱中预温5 min以上，使菌液、标准液及检测样本的温度达37℃。在波长530 nm处，1 cm光径比色皿，以双蒸水调透光度100010后，往相应编号的试管中加入200 μL待测样本或标准品，取2 mL应用菌液迅速冲入试管中，立即混匀，开始计时。之后将其迅速倒人比色皿中，在530 nm处比色，在Ss和2 min 5 s时分别读取透光值。按下式计算溶菌酶含量：, 百拇医药(刘堃 陈剑 陈胜峰 吴萍 丁磊 罗凯坤 毛觉生 王国清)