2 CRISPR/Cas9系统的应用

    目前，来自于产脓链球菌的Ⅱ型CRISPR系统已被改造为基因组定点编辑的工具。该系统具备两个最基本的成分：一个是起识别作用的cr-RNA-tracrRNA序列，另一个是起切割作用的Cas9核酸酶。在对哺乳动物细胞进行基因编辑时，需要对Cas9蛋白编码基因进行优化以及添加合适的核定位信号；此外，还需考虑是分别表达crRNA和tracrRNA还是嵌合成一条crRNA -tracrRNA，crRNA -tracrRNA又称向导RNA( gR-NA)c15]。

    自2012年首次证明CRISPR/Cas9系统可以在体外切割不同的DNA[10]以来，该系统已经成功地应用于细菌、酵母、番茄、拟南芥、大米、小麦、高粱、鼠、兔子、青蛙、果蝇、蚕、线虫、斑马鱼及人类细胞等的基因编辑中[3]。与其他人工核酸酶相比.该RNA介导的基因编辑系统一个显著的优势就是可以同时在多个不同的DNA位点进行基因编辑。例如，Cas9和多个gRNAs的同时表达，可在DSBs间造成大片段的删除和插入[16，17]；可在鼠细胞中同时诱导3个基因的突变[18]；在斑马鱼体细胞中导致5个基因的同时突变等[19] ......