人原发性结直肠恶性淋巴瘤裸小鼠原位移植高转移模型的建立(2)
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参见附件。
2.2HCBL-0301和 HRBL-0302模型的侵袭和转移
2.2.1淋巴结转移：局限于腹腔，结肠上、旁、中间和终末淋巴结，直肠旁、上动脉、肠系膜和腹股沟淋巴结，少数动物有肝门淋巴结转移。依受累程度，淋巴结转移分为三期：①早期：只在输入淋巴管和边缘窦内出现瘤细胞团；②中期：瘤细胞进一步向副皮质和髓质内侵袭性生长；③晚期：除在边缘部分残存少量淋巴结组织外，整个淋巴结几乎为瘤细胞侵占。
2.2.2肝转移：出现在原位移植第3周末，HCBL-0301模型肝转移，多局限在肝右叶，呈结节巨块形，在其周围有小瘤块散在。HRBL-0302模型肝转移呈弥漫型，瘤灶可散布在肝左、右叶甚至全肝，呈大小不一，数目不等圆形或椭圆形灰白色的瘤结节。瘤灶位于肝实质内。转移灶小至血管内瘤栓；大至肉眼可见直径为0.3mm×0.4mm和0.7mm×0.9mm。最大直径为1.5cm×2.5cm，镜下见转移瘤细胞呈侵袭性生长。严重时肝组织由瘤结节替代。
2.2.3腹腔种植转移见于腹腔脏层、壁层腹膜及网膜、胃壁、肠壁、肠系膜种植的灰白色瘤结节。有的裸鼠可见广泛腹腔种植的全腹腔癌病。
2.3移植瘤的形态学特征
2.3.1HCBL-0301光镜下瘤细胞弥漫分布，核大浓染，呈圆形、卵圆形和肾形，可见核仁，胞浆少，肠粘膜腺体被瘤细胞分隔，萎缩减少。结肠全层被无数瘤细胞浸润。电镜下瘤细胞核大，不规则，核圆形或椭圆形；异染色质沿核膜分布，呈条块状，核仁小，靠近核膜；胞质少，见少数肿胀变空线粒体及少量长的粗面内质网。
2.3.2HRBL-0302光镜下弥漫侵袭肠壁全层及粘膜表面，细胞大，卵圆形或多角形，胞浆少，可见多核瘤巨细胞，核大，呈圆形或不规则形，核染色质不均匀，可见核仁，病理核分裂相多见。电镜下瘤细胞核大。核多形性，有的核有1-2条不规则深沟及不对称分叶，呈多叶核。少数核呈圆形或卵圆形，异染色质沿核膜聚集，核仁大小不一。胞质少，有少量肿胀线粒体及扩张粗面内质网。
2.4免疫组织化学检查
HCBL-0301模型和HRBL-0302模型移植瘤细胞对CD19、CD20、CD45均呈阳性表达，对CD3、CD7 均呈阴性表达。
2.5瘤细胞DNA含量分析
HCBL-0301模型和HRBL-0302模型原位移植瘤细胞FCM检测均示异倍体，结果见表1。
表1HCBL-0301和HRBL-0302移植瘤FCM DNA检测结果(±s)
Table 1. DNA detection of transplanted tumors from HCBL-0301 and HRBL-0302 by flow cytometry (±s)
注：与结直肠正常细胞比较*P<0.01。
2.6染色体核型分析
HCBL-0301和HRBL-0302模型原位移植瘤的染色体数目分别为54-59条和56-69条，介于二倍体和三倍体之间，均为非整倍体。
3讨论
人原发性结直肠恶性淋巴瘤裸鼠原位移植高转移模型的建立过程，也是关于影响移植瘤转移诸因素的分析认识过程。移植瘤转移经历了瘤细胞从原发瘤灶脱离，通过侵袭在周围间质中生长，并与局部毛细血管或淋巴管内皮细胞密切接触并穿透其管壁；或突入腔道并被转运到靶器官，再穿透毛细血管或淋巴管壁并在基质中不断生长，形成新的肿瘤转移灶。实际上，癌转移是癌基因与抑癌基因参与调节的一个多步骤、多因素的极其复杂的过程。癌的侵袭和转移的研究，需要有相应的转移模型。Luzzi等[8]用实验性转移模型研究表明，进入血液循环中的癌细胞真正能够存活的不到0.1%，形成转移灶者不到0.01%。说明实验性模型转移率极低，建立自发性转移模型更加困难。因此，建立良好的自发性转移模型仍然是人癌转移模型研究领域的难题。经国际联机检索，纵观国际上胃肠道恶性淋巴瘤动物模型，在以前的文献中始终未见自发性高转移的人胃肠恶性淋巴瘤模型的系统报告，仅我院建立的人原发性胃恶性淋巴瘤高转移模型HGBL-0201和人小肠原发性恶性淋巴瘤高转移模型HSIL-0102为研究胃肠恶性淋巴瘤自发转移的基本实验材料[5.9]。迄今为止，人结直肠恶性淋巴瘤裸鼠原位移植高转移模型的建立均未见报道。本研究采用组织学完整的人结直肠恶性淋巴瘤新鲜组织块原位移植及体内筛选的方法，成功地建立了国际首例能完全重现人结直肠恶性淋巴瘤临床病理过程的HCBL-0301 和HRBL-0302动物模型，属于人癌高转移模型移植方法的创新，填补了国内外在这一领域里的空白。
本研究所建立的HCBL-0301和HRBL-0302模型，经过长达3年鼠间连续传代，已分别传至31代和27代，这种象结直肠恶性淋巴瘤病人样的高转移模型的移植瘤，不仅组织病理学、免疫组织化学表型，超微结构，DNA倍体水平和染色体核型的特点与人源结直肠恶性淋巴瘤细胞相一致，而且肿瘤的移植生长率和液氮冻存复苏成活率均为100%，说明该模型系统的生物学特性是稳定的。
本研究发现HCBL-0301和 HRBL-0302模型展示的生物学行为与临床病人有惊人的相似，如移植瘤在裸鼠结直肠广泛侵袭性原位生长，腹部转移，伴广泛腹腔种植的全腹腔癌病，淋巴结转移，肝转移和结直肠梗阻。这些结果完整地重现了结直肠恶性淋巴瘤患者的临床病理过程，且转移模式与临床病人相似。因此，人结直肠恶性淋巴瘤裸鼠原位移植模型是一种最接近人的结直肠恶性淋巴瘤转移模型，具有重要价值。
肿瘤转移有器官特异性，我们的实验表明肝脏是HCBL-0301和 HRBL-0302模型转移的特异器官。应用肝转移灶建立的HCBL-0301模型肝转移率之高(100%)，转移程度之重，宿主生存期之短，均说明该模型系统恶性程度高，也说明了转移灶移植是提高转移率建立高转移模型的有效方法。Cowan等报道人NHL肝转移率高达40%，而本研究326只荷瘤裸鼠HCBL-0301模型肝转移率高(100%)高于文献报道。HRBL-0302模型肝转移率为63.7%与Leichman等报道的因结直肠癌转移而死亡的患者，有45～71%存在肝转移相似。这也是本实验首次证实结直肠恶性淋巴瘤与结直肠癌肝转移的发生率和转移模式相似的报道。在这种明显肝转移表型的背后必定有其内在的转移分子机制，对肝转移灶和原发灶肿瘤细胞在体内移植进行筛选，可有助于寻找肝转移相关基因。对研究结直肠恶性淋巴瘤肝转移机制和筛选早期诊断肝转移肿瘤标志物及治疗靶标均具有重要意义 ......
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