青蛤多糖提取的条件优化及其抗肿瘤活性研究(1)
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【摘要】目的:通过考察加水量及加酸量对青蛤多糖提取率的影响,确定青蛤多糖提取的最佳工艺,并研究该多糖的抗肿瘤活性。方法:青蛤肉经蒸馏水浸泡后,酸水解法进行处理;苯酚硫酸法测糖含量。通过冷冻干燥得到青蛤多糖干品,采用MTT法考察青蛤多糖对前列腺癌细胞DU-145的增殖抑制影响。结果:每20g青蛤匀浆液,当加水量为100mL,4mol/L盐酸的加入量为120mL时,多糖的提取率最高,每100g匀浆液可提取1.8232g多糖。该糖对前列腺癌细胞具有显著的增殖抑制作用,半数抑制率为4.58mg/mL。结论:采用本方法对青蛤多糖的提取及含量测定操作简易,重现性较好,所提取的青蛤多糖具有抗肿瘤活性。
【关键词】青蛤;多糖;提取工艺;抗肿瘤活性
【中图分类号】R917【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)10-028-2
青蛤(Cyclina sinensis),俗称黑蛤、铁蛤、圆蛤、蛤蜊、牛眼蛤,分类学上隶属软体动物门、瓣鳃纲、帘蛤目、帘蛤科、青蛤属,广泛分布于辽宁、河北、山东、江苏、浙江、福建、广东、广西以及海南岛等地[1]。青蛤蛋白质含量高,脂肪含量较低,而不饱和脂肪酸含量相对较高,并含有多种维生素及微量元素,具有很高的营养及药用价值[2]。中医认为,青蛤具有清热燥湿、软坚散结和镇咳作用[3]。现代研究表明,青蛤壳具有治疗慢性气管炎、淋巴结结核、胃溃疡等多种功能;青蛤肉提取物可以体外抑制人肝癌细胞增殖,增强老龄鼠脾脏内巨噬细胞、淋巴细胞和淋巴结内巨噬细胞的活性,促进免疫细胞应答反应和提高机体免疫力等作用[4]。虽然目前从海洋生物中提取多糖并测定其抗肿瘤活性的文献已有大量报道[5-10],但是有关青蛤活性多糖的抗肿瘤活性研究至今还属空白。本研究采用酸解方法从青蛤组织中提取多糖,考察了料液比和加酸量对多糖提取率的影响,确定从青蛤中提取多糖的最佳条件,并测定该多糖体外对人肿瘤细胞的增殖抑制活性。
1材料
1.1动物与试剂
青蛤购自舟山市场(经浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定),去壳后,-20℃冷藏备用;胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司;胰蛋白酶、F12粉末培养基和MTT均购自美国SIGMA公司;二甲基亚砜购自美国AMRESCO公司。其余试剂均为分析纯。
1.2主要仪器
BSA124S型电子天平(德国,Sartorius AG公司);DS-1型高速组织捣碎机(上海标本模型厂);CF16RXII高速冷冻离心机(日立 HITACHI公司);SSW型微电脑电热恒温槽(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);722S可见分光光度计(上海恒平科学仪器有限公司);ZHJH-C1209C型超净工作台(上海智诚分析仪器制造有限公司);Forma 3111型CO2培养箱(美国Thermo公司);倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);酶标仪(美国Bio-Rad公司)。
2方法
2.1青蛤多糖提取工艺的优化
2.1.1加水量考察
青蛤肉用组织捣碎机捣碎,匀浆。分取20g三份,加入100mL,200mL,300mL蒸馏水,4℃浸泡24h,纱布过滤,5000r/min离心10min,取上清液,用透析袋将其浓缩定容至20 mL,硫酸-苯酚法测定其糖含量。
2.1.2酸解条件考察
取青蛤肉20g三份,分别加入蒸馏水100mL,浸泡24h,纱布过滤,5000r/min离心10min,取上清液。透析袋浓缩定容至20mL,加入4mol/L盐酸100mL,120mL,140mL,100℃酸解2h,冷却后用10mol/L氢氧化钠调pH约6.8,定容至250mL,5000r/min离心10min,取上清液,硫酸-苯酚法测定其糖含量。
2.2硫酸-苯酚法
精密吸取0.1mL待测溶液,定容至20mL,吸取0.1mL置于具塞试管中,依次加蒸馏水至1mL,另设空白试管加蒸馏水1mL,各加5%苯酚溶液1mL,小心振摇混匀,加入浓硫酸5mL,迅速振摇混匀,于室温下放置30min,在490nm波长处分别测定吸光度,根据标准曲线计算糖含量。
2.3标准曲线绘制
精密吸取1.00mg/mL葡萄糖标准溶液0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL,0.6mL,0.7mL,0.8mL置于10ml具塞试管中,依次加蒸馏水至1mL,另设空白试管加蒸馏水1mL,各加5%苯酚溶液1.00mL,小心振摇混匀,加入浓硫酸5mL,迅速振摇混匀,于室温下放置30min,在490nm波长处分别测定吸光度。
2.4重复性实验
取青蛤肉20g三份,分别加入蒸馏水100mL,浸泡24h,纱布过滤,5000r离心10min,取上清液。透析袋浓缩定容至20mL,加入4mol/L盐酸120mL,100℃酸解2h后,冷却用10mol/L氢氧化钠调pH约6.8,定容至250mL,5000r离心10min,取上清液,测定多糖含量和RSD。
2.5细胞培养
选取人前列腺癌细胞DU145(原购自中科院上海细胞库,由本实验室传代保存),用含10%小牛血清的RPMI1640完全培养基于37℃,5% CO2培养箱中培养至对数生长期。
2.6细胞增殖抑制率的测定
采用MTT法进行检测[11]。配制PBS溶液(PH值为7.2)和浓度分别为1.5mg/mL,2.5mg/mL,3.5ml/mL,4.5mg/mL,5.5mg/mL,6.5mg/mL的青蛤多糖溶液。取对数生长期的细胞制成悬液,接种至96孔板,每孔200μL,于5% CO2,37 ℃贴壁4h,然后分别加入不同浓度的青蛤多糖溶液,每个浓度设3个平行孔,同时设不加药对照组,置5% CO2,37 ℃培养箱中孵育48h,培养结束加MTT继续培养4h,吸弃MTT,置酶联免疫检测仪在490nm测吸光度,计算细胞增殖抑制指数(IR),按下列公式计算 ......
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