噬菌体生物扩增法检测肺泡灌洗液结核分枝杆菌的临床研究(1)
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2010年8月1日
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【摘要】目的:探讨噬菌体生物扩增法(phaB)检测肺泡灌洗液中结核分枝杆菌的临床应用价值。方法:收集疑诊为肺结核,未予抗结核的初治患者肺泡灌洗液标本80例,同时应用PhaB法、荧光涂片法、聚合酶链反应技术法(PCR检测法)、罗氏培养法进行检测,对照分析检测结果。结果:80例患者纤支镜检查有46例发现异常,使用PhaB法、荧光涂片法、聚合酶链反应技术、罗氏培养法检查阳性率分别为58.8%、47.5%、65%、76.3%;PhaB法和聚合酶链反应技术两种方法联合检测敏感性为88.5%,特异性为89.5%。结论:PhaB检测疑诊为肺结核的未予抗结核患者肺泡灌洗液结核分枝杆菌,有较高的敏感性和特异性,联合荧光涂片法和聚合酶链反应技术检测可进一步提高其敏感性。
【关键词】噬菌体生物扩增法;聚合酶链反应技术;结核;分枝杆菌
【中图分类号】R378.91+1【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)16-159-2
结核分枝杆菌感染人体而引发的结核病是全球性的严重危害人类的传染性疾病之一。我国作为发展中国家,结核病的控制更是任重道远。在结核病控制中,寻求经济,快速,敏感性和特异性较高的结核菌检测方法,为结核的早期诊断提供依据是众多临床医师所希望。目前痰荧光涂片灵敏度较差,并受痰样本数和病情的影响,一般认为活动性肺结核涂阳率约40-50%[1];罗氏培养法阳性率较高约50-80%[1],但需要平均时间约4-8周。本研究通过PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法检测肺泡灌洗液中结核分枝杆菌,通过对照评价PhaB法在肺结核诊断中的使用价值及优缺点。
1资料与方法
1.1临床资料选取2008-2010年广州市胸科医院疑诊初治肺结核住院患者80例,其中男性35例,女性25例,年龄19～65岁,平均年龄38.5±7.5岁。入选条件:疑诊为初治肺结核并支气管结核,未开始抗结核治疗;三个月内未接受喹诺酮类和氨基糖甙类抗生素治疗。
1.2方法
1.2.1PhaB法结核分枝杆菌噬菌体生物扩增试剂盒(FAST plaue TB)由英国BDTEC公司生产,由上海市金浩科技发展有限公司提供。
1.2.2支气管冲洗液标本收集按支气管镜检查常规进行术前准备和麻醉,通过胸部CT或胸片初步确定重点检查部位。气管镜经鼻腔进入,通过声门逐步检查气管,支气管。对镜下可见病变部位,可先后进行支气管粘膜活检和支气管刷检,随后进行支气管冲洗,将生理盐水5～10毫升注入相应的肺叶和肺段病变部位进行冲洗,用吸引器将冲洗液收集入标本瓶中送检,共2-3次。对镜下病变部位不明显处,将纤支镜插入病灶最多部位所在的支气管开口按上述方法进行刷检、冲洗,留取标本。
1.2.3噬菌体生物扩增法按试剂盒(FASTPlaqueTBTM)说明书配制所需试剂,包括培养基-生物添加剂、琼脂、噬菌体和敏感细胞等,全部操作在无菌操作台进行。肺泡灌洗液洗标本的处理:取灌洗液标本5ml,加入1倍体积的4%NAOH溶液混匀常温静置15min去污染。加入磷酸缓冲液(PH6.8)离心20min,弃去上清液。重悬沉淀物,4000g离心15min,弃去上清液,重悬沉淀物,无菌条件下吸取1ml重悬液加入孵育管中,37℃孵育24小时。检测:每次取1ml处理后的样品加入各反应管中,阴性对照不加标本,阳性对照加入1:1000稀释度的敏感细胞液。加入100ul噬菌体溶液在37℃条件下培育1h。在每个反应管中加入100ul强效杀毒剂溶液,上下充分混匀,室温放置5min后加入5ml培养基-生长添加剂和1ml敏感细胞液。将反应管中所有反应混合物倒入培养皿中,加入5ml融化的琼脂,快速混匀静置成型。37℃温育18-24小时后观察结果。结果判断:噬菌斑数≦19个阴性,≧20个位阳性。
1.2.4其他检测方法荧光涂片法:用金胺“O”荧光染色涂片法,荧光显微镜检每50个视野≥10-99条抗酸杆菌为阳性;结核菌培养:用BacT/Alert3D全自动分枝杆菌快速培养仪按照仪器使用说明书进行临床标本的分离培养;荧光定量聚合酶链反应技术(PCR检测):检测冲洗液结核分枝杆菌DNA片段,TB-DNA基因拷贝数量>1×103拷贝/mL阳性
1.2.5统计学处理采用SPSS统计软件进行分析,用X2检验比较不同检测方法的阳性率,P<0.05为差异有统计学上意义。
2结果
初步诊断为肺结核合并支气管内膜结核的,未予抗痨治疗的纤支镜肺泡灌洗液标本80例。使用PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法四种检测方法,PhaB法阳性率58.8%,荧光涂片法阳性率为47.5%,PCR检测法阳性率65%,快速培养法阳性率76.3%。其中,PhaB法检测阳性率明显高于荧光涂片法,检验差异有显著性意义(X2=4.27,P<0.05);PhaB法和聚合酶链反应技术法检出率无显著性差异(X2=1.78,P>0.05),提示两者阳性检出率类似;PhaB法与罗氏培养法比较检验有显著性差异(X2=12.07,P<0.05),提示对比罗氏培养法PhaB法阳性检出率稍差。联合①②③阳性检出率为82.5%和④比较(X2=0.09,P>0.05)。
表一 80例初步诊断肺结核肺泡灌洗液使用PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法进行检测阳性结果
方法标本例数阳性例数阳性检出率(%)
①PhaB法804758.8
②荧光涂片法803847.5
③PCR检测805265
①③两种方法联合805872.5
④罗氏培养法806176.3
PhaB法检出的47份阳性标本中,荧光涂片法检出35例阳性;PhaB法检出的33份阴性标本中,荧光涂片法检出30例阴性。PCR法检测的52份阳性标本中,PhaB法检出41份,检出率78.8%;罗氏培养法阳性的61例标本中,PhaB法检测出44份,检出率72.1%。
表二 80例初步诊断肺结核肺泡灌洗液使用PhaB法、荧光涂片法、PCR检测法、罗氏培养法进行检测结果比较
荧光涂片法PCR检测法罗氏培养法
阳性阴性阳性阴性阳性阴性
PhaB法阳性(n=47)3512452470
阴性(n=33)3307261419 ......
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