大黄特征图谱研究及游离蒽醌含量测定
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2010年9月1日
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【摘要】目的:建立大黄不同炮制品的特征图谱,对其中5种游离蒽醌类成分进行比较研究。方法:HPLC-DAD法建立大黄的特征图谱,同时测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种游离蒽醌的含量。流动相甲醇-0.1%HAc水梯度洗脱,检测波长270nm、420nm,流速0.8ml/min;柱温25℃。结果:所建立的特征图谱信息丰富,5个游离蒽醌在测定范围内线性关系较好(r>0.9999),平均回收率分别为100.3%、99.55%、96.56%、99.84%、101.3%。结论:不同炮制品其特征图谱有所差别,游离蒽醌表现出一些规律性的变化。
【关键词】大黄;特征图谱;游离蒽醌
【中图分类号】R286.0【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)18-030-2
大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palamatum L、唐古特大黄R.tanguticum Maxim exBalf.或药用大黄R.officinale Bail的干燥根及根茎[1]。神农本草经中记述,大黄味苦寒,归胃、肝大肠经。大黄具有抗菌、泻下、止血、抗肿瘤、抗衰老等多种生物活性,临床上常以不同的炮制品组方入药发挥不同的功效,如生大黄苦寒沉降泻下作用为主,酒大黄苦寒泻下作用缓和,炭大黄具有止血作用。蒽醌类成分是大黄的主要有效成分,在治疗疾病过程中起着重要的作用,同时这类成分与其炮制品的功效变化密切相关[2-3]。本实验以HPLC-DAD法建立了大黄不同炮制品的特征图谱,并测定了大黄不同炮制品中5种游离蒽醌类成分的含量,比较了这类成分在大黄炮制过程中的变化,以期为大黄的质量控制及临床应用提供依据。
1仪器与试药
Agilent1200色谱工作站系统(G1315D型DAD检测器,G1316A恒温柱箱,G1312A二元泵,G1322A在线脱气机,G1329A自动进样器);超声清洗器KQ-100(昆山市超声仪器有限公司);十万分仪器之一分析天平BP211D(Sartorius赛多利斯科)。甲醇为色谱纯(山东禹王),水为超纯水(江苏省方剂重点实验室),使用前均经0.45μm滤膜滤过;其余试剂均为分析纯。
对照品大黄酸(110756-200110)、大黄素甲醚(1107
58-200611)购自中国药品生物制品检定所,大黄素、大黄酚和芦荟大黄素由本中药化学实验室从大黄药材中分离鉴定,纯度均为98%以上。
样品:大黄药材、大黄饮片、酒大黄、大黄炭和熟大黄,各三个批号(080619甘肃礼县,080620青海,080621四川甘孜)。临用前分别粉碎过40目筛后备用。
2方法
2.1HPLC-DAD分析条件色谱柱为Agilent Eclipse XDB--C18柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相为甲醇(A)-1%HAc(B)水,梯度洗脱[0-8min,10%-20%(A);8-20min,20%-35%(A);20-60min,35%-75%(A);60-75min,75%-100%(A);75-85min,100%-10%(A)];检测波长270nm、430nm;流速0.8ml/min;柱温25℃。在430nm下大黄样品中五种成分分离度好(图1)。
2.2对照品溶液的制备精密称取大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、芦荟大黄素和大黄酸对照品各适量,分别加甲醇制成0.126,0.14,0.133,0.123,0.0505mg/ml的溶液,作为对照品储备液。于4℃下冷藏,备用。临用前精密量取上述对照品储备液各1.8ml,1ml,3.5ml,1ml,2ml加甲醇定容至10ml得到混合对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备取大黄不同饮片粉末各约0.2g,精密称定,置于100ml圆底烧瓶中,加50ml甲醇,水浴加热回流3h,放冷,滤过,用少量甲醇分次洗涤容器及残渣,合并滤液与洗液,浓缩并定容至10ml量瓶中,摇匀,滤过,取续滤液,以0.45um微孔滤膜滤过,即得供试品溶液。
2.4方法学实验
2.4.1线性关系考察取上述混合对照品溶液分别进样1,5,10,20,30uL,依法测定,以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线,并计算回归方程:芦荟大黄素Y=2797.4X-3.8456,r=1.0000;大黄酸Y=2365.5X-7.6227,r=0.9999;大黄素Y=2113.6X-4.7708,r=1.0000;大黄酚Y=3393.5X-8.7039,r=1.0000;大黄素甲醚Y=3091.9X-8.3366,r=0.9999。结果表明芦荟大黄素在0.0123～0.369ug,大黄酸在0.101～3.03ug,大黄素在0.02268～0.6804ug,大黄酚在0.04655～1.3965ug,大黄素甲醚在0.014～0.42ug线性关系良好。
2.4.2精密度试验精密吸取混合对照品溶液10uL,连续进样5次,依法测定,结果测得峰面积的RSD为芦荟大黄素1.46%,大黄酸0.70%,大黄素2.44%,大黄酚2.96%,大黄素甲醚0.03%。表明仪器精密度良好。
2.4.3稳定性试验取大黄原药材粉末(批号:Y080620),按供试品溶液制备方法制备供试品溶液,精密吸取5μl,分别在0、3、6、9、12、24h进样,共进样6次,计算测得峰面积的RSD为芦荟大黄素2.18%,大黄酸1.61%,大黄素2.39%,大黄酚2.01%,大黄素甲醚2.10%。结果表明供试品溶液在24小时内基本稳定。
2.4.4重复性试验取大黄原药材粉末(批号:Y080620)5份,各约0.2g,精密称定,按供试品溶液制备方法分别制备供试品溶液,进样5μl,依法测定并计算含量,结果RSD值分别为芦荟大黄素2.76%,大黄酸1.91%,大黄素1.88%,大黄酚2.25%,大黄素甲醚1.88%。
2.4.5加样回收率试验精密称定已知含量的大黄原药材粉末(批号:Y080620)5份,各0.1g,分别精密加入各对照品适量,按供试品溶液制备及测定方法操作,测定结果见表1。
2.5样品测定取大黄不同来源饮片,依法制成供试品溶液,进液相色谱分析。结果见表2。
3结果和讨论
本文以HPLC法建立了大黄的特征图谱,并对大黄不同炮制品中的5种游离蒽醌进行了含量测定。实验中曾比较了超声、回流等提取方法,发现采用回流法提取效率最高。经方法学考察,表明该方法灵敏可靠、重现性好。实验中还考察了流动相体系(甲醇-0.1%H3PO4与甲醇-1%HAc)和检测波长(254nm、270nm、430nm),结果显示,以甲醇-1%HAc水梯度洗脱,样品主峰达到较好的基线分离,在270nm处色谱信息最为丰富,在430nm下五种游离蒽醌类成分响应较高,可作为含量测定的检测波长。
1.大黄药材2.生大黄3 ......
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