不同消化时间下胶原酶对人脐带间充质干细胞分离的影响(2)
| 第1页 |
参见附件。
间充质干细胞在组织中的比例极低，因此，如何获取高纯度的间充质干细胞相当重要。目前最常用的分离间充质干细胞的方法有贴壁培养法、胶原酶法、胰酶-胶原酶法，一些实验研究者通过组织块培养法收获的原代细胞产量比对应的酶消化法要多且成功率高，降低了培养的成本和难度，避免了培养中异种蛋白的混入，进而降低其临床排斥反应[8]。
本研究从足月胎儿脐带中分离出MSCs，通过比较不同消化时间对所收获间充质干细胞的影响，并观察和研究其形态学、生长特性、细胞周期及免疫表型。
1 材料和方法
11 主要仪器和试剂 离心机(Beckman Coulter X-15R)，75T培养瓶(Corning Incorporated)，倒置显微镜(OLYMPUS CKX41)，孵箱(Thermo CO2孵箱3111)，流式细胞仪(BD FACS Calibur)，DMEM/F12、胶原酶Ⅱ、025%胰酶(GIBCO)，PE标记的CD34、CD45、CD73、CD105、FITC标记的HLA-ABC、HLA-DR(BD Parmingen)。具体见表1。
12 人脐带MSCs的分离、培养及扩增 无菌采集健康胎儿脐带15根，各取15cm随机分为15组，再将每组脐带平均分为3等份，用加有双抗的生理盐水充分清洗，去除脐静脉及动脉内的残留血液，将其剪碎成1mm3的组织块，移至质量体积分数为10%的胶原酶Ⅱ中，37℃分别消化3h、5h、7h，200目滤网过滤，收集含细胞的滤液，4℃、2000r/min离心5min，弃上清，保留沉淀，用DMEM/F12将细胞轻轻吹打成单细胞悬液，充分洗涤，4℃、300r/min离心5min，弃上清，保留细胞沉淀，用体积分数为12%FBS的DMEM/F12重悬，制成单细胞悬液，胎盼蓝计数法计活细胞数后，接种于25T培养瓶中，置于37℃、体积分数5% CO2的饱和湿度孵箱内培养。5～6d后首次全量换液，去除未贴壁细胞，以后每隔3～4d换液1次。倒置显微镜下观察细胞达85%以上融合后，用质量体积分数为025%的胰酶消化细胞 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件。