红花注射液对人肺癌A549细胞体外抑制的实验研究
【摘 要】 目的：探讨红花注射液对人肺癌A549细胞体外增殖的影响。方法：采用MTT法测定了不同剂量的红花注射液对A549细胞体外增殖的抑制作用。结果：红花注射液对A549细胞增殖有较强的抑制作用；呈现良好的量效关系和时效关系。结论：红花注射液对人肺癌A549细胞的增殖有较强的抑制作用。
【关键词】 红花注射液；肺癌；细胞株A549；抑制作用
【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2015)12-0011-02
红花在祖国医药学中的应用已有悠久的历史，主要活性成分为红花黄色素、黄酮类、脂肪酸、多糖，临床主要用于月经不调、痛经、经闭、跌打损伤、冠心病、血管栓塞性疾病、传染性肝炎等的治疗[1-3]。本试验测定了不同剂量的红花注射液对人肺癌A549细胞的外体抑制作用，为红花抗肿瘤的深入研究及今后的临床应用提供参考依据。
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1 材料和方法
1.1 材料 ①红花注射液(山西安特生物制药股份有限公司，国药准字Z14020734，批号 20090614)；②人肺癌细胞株A549，由河北大学生命科学学院提供。
1.2 试剂与仪器 ①试剂：RPMI 1640培养基和胰蛋白酶(GIBCO公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；二甲亚砜(美国SIGMA公司)；青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)。②仪器：CO2培养箱(MCO-20AIC，日本三洋公司)；生物安全柜(BHC-1300IIA2，苏州苏洁净化设备有限公司)；倒置显微镜(IX83，日本奥林巴斯公司)；酶标仪(HT2，美国BIO-RED公司)。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养 A549细胞复苏后，贴壁生长于含10% 胎牛血清、青霉素和链霉素各100U/ml 的RPMI 1640完全培养液中，并置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
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1.3.2 红花注射液对A549细胞增殖的影响 采用MTT法，将A549细胞按照5×104个/ml的密度接种到96孔培养板中，试验分为以下几组：红花注射液组(10μl、20μl、40μl、80μl)、阴性对照组(加相同剂量的生理盐水终体积为200μl/孔)。分别培养24h、48h和72h后加入5μg/μl的MTT液，继续培养4h，弃上清液，加入二甲亚砜(DMSO)，磁力震荡15min，用酶标仪测定各孔吸光度A值，测定波长λ=570 nm，计算细胞增殖的抑制率：抑制率(%)=(阴性对照组A值-红花注射液组A值)/ 阴性对照组A值×100%[4]。
1.3.3 细胞形态学观察 取生长状态良好的A549细胞接种于48 孔细胞培养板内，培养24h，红花注射液组加入40μl/孔的红花注射液，阴性对照组加入生理盐水，培养24h后在倒置显微镜下观察细胞形态。
1.4 统计学分析 采用统计学软件SPSS 16.0进行分析，实验数据以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
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2 结果
2.1 红花注射液对A549细胞增殖的抑制作用 红花注射液(10μl/孔、20μl/孔、40μl/孔和80μl/孔)分别作用A549细胞24、48、72 h后，与阴性对照组比较，各剂量的红花注射液在12、48、72 h对A549细胞增殖均有抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)。且随着药物剂量的提高和刺激时间的延长，红花注射液对A549细胞的抑制作用也逐渐增强，即具有剂量和时间依赖性(表1)。
2.2 细胞形态学变化 阴性对照组A549细胞贴壁良好，呈多角形或长梭形，边界清晰，排列无方向性。红花注射液组细胞多呈圆形，边界胞膜起皱，可见大量悬浮细胞和碎片(图1)。
3 讨论
红花注射液是从野生红花药材中经过精制而成的中药注射液，主要含有红花黄色素、红花醌苷、红花素、新红花苷等成份[5-6]。据报道，红花注射液对体外培养的Hela细胞、HepG-2 细胞的增殖有较强的抑制作用，并能促进细胞凋亡，其机制可能与抑制细胞中Survivin、Bcl-2蛋白的表达有关[7-8]。本试验结果显示，红花注射液对体外培养的人肺癌A549细胞增殖有较强的抑制作用，并呈现良好的量效和时效关系，随着药物剂量和作用时间的增加，抑制作用明显增强，但是其抑制细胞增殖的机制还有待进一步研究。
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参考文献
[1]汪宏雷.红花的药理作用[J].中医药临床杂志，2014，26(5)：519.
[2]万春平.红花的研究进展[J].时珍国医国药，2011，14(1)：243.
[3]李宝军，刘志强.红花药理分析及临床应用研究[J].亚太传统医药，2014，10(15)：44-45.
[4]司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安：世界图书出版公司，2004：186-191.
[5]赵剑锋，刘静，郭颖，等.红花注射液化学成分及其活性研究[J].中国中药杂志，2014，39(16)：3102-3106.
[6]别磊，柴乃俊，常成，等.基于文献的红花注射液安全性研究[J].中国中医药信息杂志，2014，21(11)：37-41.
[7]靳祎，石少慧，王恩军，等.红花注射液对人宫颈癌细胞株Hela体外增殖的影响[J].军医进修学院学报，2007，28(6)： 448.
[8]李福娟，石学魁，李玉婷，等.红花注射液对HepG-2细胞Bcl-2和Survivin表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(21)：218-222.
(收稿日期：2015.04.21), 百拇医药(范林林等)
【关键词】 红花注射液；肺癌；细胞株A549；抑制作用
【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2015)12-0011-02
红花在祖国医药学中的应用已有悠久的历史，主要活性成分为红花黄色素、黄酮类、脂肪酸、多糖，临床主要用于月经不调、痛经、经闭、跌打损伤、冠心病、血管栓塞性疾病、传染性肝炎等的治疗[1-3]。本试验测定了不同剂量的红花注射液对人肺癌A549细胞的外体抑制作用，为红花抗肿瘤的深入研究及今后的临床应用提供参考依据。
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1 材料和方法
1.1 材料 ①红花注射液(山西安特生物制药股份有限公司，国药准字Z14020734，批号 20090614)；②人肺癌细胞株A549，由河北大学生命科学学院提供。
1.2 试剂与仪器 ①试剂：RPMI 1640培养基和胰蛋白酶(GIBCO公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；二甲亚砜(美国SIGMA公司)；青霉素、链霉素(华北制药股份有限公司)。②仪器：CO2培养箱(MCO-20AIC，日本三洋公司)；生物安全柜(BHC-1300IIA2，苏州苏洁净化设备有限公司)；倒置显微镜(IX83，日本奥林巴斯公司)；酶标仪(HT2，美国BIO-RED公司)。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养 A549细胞复苏后，贴壁生长于含10% 胎牛血清、青霉素和链霉素各100U/ml 的RPMI 1640完全培养液中，并置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
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1.3.2 红花注射液对A549细胞增殖的影响 采用MTT法，将A549细胞按照5×104个/ml的密度接种到96孔培养板中，试验分为以下几组：红花注射液组(10μl、20μl、40μl、80μl)、阴性对照组(加相同剂量的生理盐水终体积为200μl/孔)。分别培养24h、48h和72h后加入5μg/μl的MTT液，继续培养4h，弃上清液，加入二甲亚砜(DMSO)，磁力震荡15min，用酶标仪测定各孔吸光度A值，测定波长λ=570 nm，计算细胞增殖的抑制率：抑制率(%)=(阴性对照组A值-红花注射液组A值)/ 阴性对照组A值×100%[4]。
1.3.3 细胞形态学观察 取生长状态良好的A549细胞接种于48 孔细胞培养板内，培养24h，红花注射液组加入40μl/孔的红花注射液，阴性对照组加入生理盐水，培养24h后在倒置显微镜下观察细胞形态。
1.4 统计学分析 采用统计学软件SPSS 16.0进行分析，实验数据以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
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2 结果
2.1 红花注射液对A549细胞增殖的抑制作用 红花注射液(10μl/孔、20μl/孔、40μl/孔和80μl/孔)分别作用A549细胞24、48、72 h后，与阴性对照组比较，各剂量的红花注射液在12、48、72 h对A549细胞增殖均有抑制作用，差异有统计学意义(P<0.05)。且随着药物剂量的提高和刺激时间的延长，红花注射液对A549细胞的抑制作用也逐渐增强，即具有剂量和时间依赖性(表1)。
2.2 细胞形态学变化 阴性对照组A549细胞贴壁良好，呈多角形或长梭形，边界清晰，排列无方向性。红花注射液组细胞多呈圆形，边界胞膜起皱，可见大量悬浮细胞和碎片(图1)。
3 讨论
红花注射液是从野生红花药材中经过精制而成的中药注射液，主要含有红花黄色素、红花醌苷、红花素、新红花苷等成份[5-6]。据报道，红花注射液对体外培养的Hela细胞、HepG-2 细胞的增殖有较强的抑制作用，并能促进细胞凋亡，其机制可能与抑制细胞中Survivin、Bcl-2蛋白的表达有关[7-8]。本试验结果显示，红花注射液对体外培养的人肺癌A549细胞增殖有较强的抑制作用，并呈现良好的量效和时效关系，随着药物剂量和作用时间的增加，抑制作用明显增强，但是其抑制细胞增殖的机制还有待进一步研究。
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参考文献
[1]汪宏雷.红花的药理作用[J].中医药临床杂志，2014，26(5)：519.
[2]万春平.红花的研究进展[J].时珍国医国药，2011，14(1)：243.
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[4]司徒镇强，吴军正.细胞培养[M].西安：世界图书出版公司，2004：186-191.
[5]赵剑锋，刘静，郭颖，等.红花注射液化学成分及其活性研究[J].中国中药杂志，2014，39(16)：3102-3106.
[6]别磊，柴乃俊，常成，等.基于文献的红花注射液安全性研究[J].中国中医药信息杂志，2014，21(11)：37-41.
[7]靳祎，石少慧，王恩军，等.红花注射液对人宫颈癌细胞株Hela体外增殖的影响[J].军医进修学院学报，2007，28(6)： 448.
[8]李福娟，石学魁，李玉婷，等.红花注射液对HepG-2细胞Bcl-2和Survivin表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(21)：218-222.
(收稿日期：2015.04.21), 百拇医药(范林林等)