HPLC法测定“额力根一号”中羟基红花黄色素A的含量
【摘 要】 目的：测定额力根一号中羟基红花黄色素A的含量。方法：采用HPLC法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)，检测波长为403nm，流速为1.0mL/min。结果：羟基红花黄色素A在0.3762～3.7620μg(r=0.99991)范围内呈良好的线性关系。羟基红花黄色素A平均加样回收率为97.3%。结论：该方法简便、灵敏，可用于制剂的质量控制。
【关键词】 额力根一号；羟基红花黄色素A；HPLC
【中图分类号】R914.4 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2016)24-0018-03
Abstract：Objective HPLC determination of hydroxysafflor yellow A in eligen Ⅰ.Methods The HPLC method was used.Octadecyl silane bonded silica gel as a filler ，The mobile phase was a mixture of methanol-acetonitrile-0.7% aqueous phosphoric acid(26∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]72) at a flow rate of 1.0mL·min-1 ，and the detecting wavelength was at 403 nm.Results The linear range of hydroxysafflor yellow A was 0.3762～3.7620μg(r=0.99991) and the average recovery rate was 97.3%.Conclusion The method is simple，rapid and accurate.It could be used for the quality control of eligen Ⅰ.
Keywords：Eligen Ⅰ；Hydroxysafflor Yellow A； HPLC
额力根一号(肝一号)是由丹参、鳖甲、黄芪、党参、当归、三七、柴胡、红花、枸杞子、北豆根、赤芍、青篙、阿胶、拳参、生地十五味药组成的复方制剂，主要治疗肝肿大、肝脓肿、肝癌、肝硬化以及酒精引起的胃酸过多等。额力根一号方中的主要成分红花有活血通经、祛瘀止痛的功效。而羟基红花黄色素A为红花的水溶性成分，具有抑制血小板聚集、抗氧化、抗炎等多种药理活性[1]，本文采用方法简单、准确、重现性好的HPLC法来测定额力根一号中羟基红花黄色素A的含量，实现对额力根一号的质量控制。
1 仪器与试药
1.1 仪器 LC-10AT，SPD-10Avp，SIL-HTA，CLASS-VP。
1.2 试药 羟基红花黄色素A(中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。批号：111637—200503)；额力根一号(批号：090525、090603、090326由内蒙古通辽市库伦旗蒙医医院制剂室提供)。
2 方法和结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)，柱温：30℃，检测波长为403nm，流速为1.0mL/min，进样量10μL。理论板数：按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。
2.2 对照品溶液的制备 称取羟基红花黄色素A对照品13mg，精密称定，置100mL量瓶中，加25%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(制成每1mL含0.13mg的溶液)。
2.3 供试品溶液的制备 取额力根一号粉末(过三号筛)约6.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率50kHz)40min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得额力根一号样品溶液。
2.4 阴性对照溶液的制备 按照额力根一号处方制成阴性对照溶液(不含红花)。
2.5 干扰实验 取三种溶液(对照品、阴性及额力根一号溶液)各10μL分别进样检测，结果可见：额力根一号配方中没有对羟基红花黄色素A产生干扰的成分，色谱图见图1～3。
2.6 线性试验 分别取2、4、8、12、15和20μL对照品溶液(羟基红花黄色素A)，进样。按上述色谱条件进行测定，以对照品进样量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。羟基红花黄色素A在0.3762～3.7620μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为：Y=1.0476×106X-3.7547×104 ，r=0.99991。
2.7 精密度试验 取“2.2”项下的羟基红花黄色素A对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，测定羟基红花黄色素A峰面积，结果羟基红花黄色素A峰面积的RSD(n=6)为1.10%。
2.8 重复性试验 在上述色谱条件下，分析测定由同一批额力根一号样品制备的6份供试品溶液。结果羟基红花黄色素A含量的平均值(n=6)为0.973 mg·g-1，RSD为0.20%。见表1。
2.9 稳定性试验 取同一额力根一号供试品溶液，室温放置，分别于0，2，4，6，8，12，18，30h按上述色谱条件测定。测得羟基红花黄色素A的平均峰面积为1307572，RSD(n=6)为1.30%。结果表明额力根一号供试品溶液在室温条件下放置30h依然稳定。
2.10 回收率试验 精密称取已知含量的样品额力根一号约3.0g，共9份，分别添加羟基红花黄色素A对照品溶液适量，按上述方法测定含量后计算回收率。结果如下表。羟基红花黄色素A平均回收率(n=9)为97.3%。
2.11 样品测定 取额力根一号，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，记录色谱峰面积，计算含量。结果见表3。
3 讨论
3.1 测定波长的选择 配制一定浓度的羟基红花黄色素A对照品溶液，分别在210～600nm波长内进行全扫描，羟基红花黄色素A在403nm处有较强的紫外吸收。实验选择403nm进行测得。
3.2 提取溶剂的选择 据文献[2]，药材红花的羟基红花黄色素A含量测定方法中，选用25%甲醇作为提取溶剂，超声提取40min，故本研究也采用25%甲醇作为提取溶剂，超声提取40min。
3.3 定量方法的建立 本研究建立了一种准确可靠、专属性强、简单快捷的定量方法，通过对羟基红花黄色素A的含量测定，达到控制额力根一号制剂质量的目的。
参考文献
[1]刘永刚，李芳君，汤芳.羟基红花黄色素A对大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用[M].中国药理与临床，2015，31(1)：71-73.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2015：151.
(编辑：梁志庆) (赵东鲲 包长龙)
【关键词】 额力根一号；羟基红花黄色素A；HPLC
【中图分类号】R914.4 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2016)24-0018-03
Abstract：Objective HPLC determination of hydroxysafflor yellow A in eligen Ⅰ.Methods The HPLC method was used.Octadecyl silane bonded silica gel as a filler ，The mobile phase was a mixture of methanol-acetonitrile-0.7% aqueous phosphoric acid(26∶[KG-*3/5]2∶[KG-*3/5]72) at a flow rate of 1.0mL·min-1 ，and the detecting wavelength was at 403 nm.Results The linear range of hydroxysafflor yellow A was 0.3762～3.7620μg(r=0.99991) and the average recovery rate was 97.3%.Conclusion The method is simple，rapid and accurate.It could be used for the quality control of eligen Ⅰ.
Keywords：Eligen Ⅰ；Hydroxysafflor Yellow A； HPLC
额力根一号(肝一号)是由丹参、鳖甲、黄芪、党参、当归、三七、柴胡、红花、枸杞子、北豆根、赤芍、青篙、阿胶、拳参、生地十五味药组成的复方制剂，主要治疗肝肿大、肝脓肿、肝癌、肝硬化以及酒精引起的胃酸过多等。额力根一号方中的主要成分红花有活血通经、祛瘀止痛的功效。而羟基红花黄色素A为红花的水溶性成分，具有抑制血小板聚集、抗氧化、抗炎等多种药理活性[1]，本文采用方法简单、准确、重现性好的HPLC法来测定额力根一号中羟基红花黄色素A的含量，实现对额力根一号的质量控制。
1 仪器与试药
1.1 仪器 LC-10AT，SPD-10Avp，SIL-HTA，CLASS-VP。
1.2 试药 羟基红花黄色素A(中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用。批号：111637—200503)；额力根一号(批号：090525、090603、090326由内蒙古通辽市库伦旗蒙医医院制剂室提供)。
2 方法和结果
2.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26∶2∶72)，柱温：30℃，检测波长为403nm，流速为1.0mL/min，进样量10μL。理论板数：按羟基红花黄色素A峰计算应不低于3000。
2.2 对照品溶液的制备 称取羟基红花黄色素A对照品13mg，精密称定，置100mL量瓶中，加25%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(制成每1mL含0.13mg的溶液)。
2.3 供试品溶液的制备 取额力根一号粉末(过三号筛)约6.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50mL，称定重量，超声处理(功率300W，频率50kHz)40min，放冷，再称定重量，用25%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得额力根一号样品溶液。
2.4 阴性对照溶液的制备 按照额力根一号处方制成阴性对照溶液(不含红花)。
2.5 干扰实验 取三种溶液(对照品、阴性及额力根一号溶液)各10μL分别进样检测，结果可见：额力根一号配方中没有对羟基红花黄色素A产生干扰的成分，色谱图见图1～3。
2.6 线性试验 分别取2、4、8、12、15和20μL对照品溶液(羟基红花黄色素A)，进样。按上述色谱条件进行测定，以对照品进样量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。羟基红花黄色素A在0.3762～3.7620μg范围内呈良好的线性关系，回归方程为：Y=1.0476×106X-3.7547×104 ，r=0.99991。
2.7 精密度试验 取“2.2”项下的羟基红花黄色素A对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，测定羟基红花黄色素A峰面积，结果羟基红花黄色素A峰面积的RSD(n=6)为1.10%。
2.8 重复性试验 在上述色谱条件下，分析测定由同一批额力根一号样品制备的6份供试品溶液。结果羟基红花黄色素A含量的平均值(n=6)为0.973 mg·g-1，RSD为0.20%。见表1。
2.9 稳定性试验 取同一额力根一号供试品溶液，室温放置，分别于0，2，4，6，8，12，18，30h按上述色谱条件测定。测得羟基红花黄色素A的平均峰面积为1307572，RSD(n=6)为1.30%。结果表明额力根一号供试品溶液在室温条件下放置30h依然稳定。
2.10 回收率试验 精密称取已知含量的样品额力根一号约3.0g，共9份，分别添加羟基红花黄色素A对照品溶液适量，按上述方法测定含量后计算回收率。结果如下表。羟基红花黄色素A平均回收率(n=9)为97.3%。
2.11 样品测定 取额力根一号，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，记录色谱峰面积，计算含量。结果见表3。
3 讨论
3.1 测定波长的选择 配制一定浓度的羟基红花黄色素A对照品溶液，分别在210～600nm波长内进行全扫描，羟基红花黄色素A在403nm处有较强的紫外吸收。实验选择403nm进行测得。
3.2 提取溶剂的选择 据文献[2]，药材红花的羟基红花黄色素A含量测定方法中，选用25%甲醇作为提取溶剂，超声提取40min，故本研究也采用25%甲醇作为提取溶剂，超声提取40min。
3.3 定量方法的建立 本研究建立了一种准确可靠、专属性强、简单快捷的定量方法，通过对羟基红花黄色素A的含量测定，达到控制额力根一号制剂质量的目的。
参考文献
[1]刘永刚，李芳君，汤芳.羟基红花黄色素A对大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用[M].中国药理与临床，2015，31(1)：71-73.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2015：151.
(编辑：梁志庆) (赵东鲲 包长龙)