大鼠同种异体神经支架修复神经缺损的实验研究(1)
【摘 要】 目的：比较经脱细胞处理的同种异体神经支架修复大鼠坐骨神经缺损与自体神经移植修复效果的区别。方法：32只SD大鼠随机分为2组，每组16只，分别为脱细胞神经支架修复坐骨神经缺损组(A组)和自体移植组(B组)。术后利用HE染色和透射电镜观察支架内结缔组织重塑情况和神经超微结构的改变。结果：与自体移植组相比，单纯脱细胞神经支架组细胞分布较紊乱，说明支架内结缔组织已有增生重塑现象。通过透射电镜观察发现，单纯脱细胞支架组的髓鞘形态与自体移植组的显微结构没有明显的差异。结论：脱细胞异体神经支架异体移植后，能与自体神经移植修复缺损神经产生相似的移植效果。
【关键词】 神经支架；神经缺损；大鼠
【中图分类号】R745 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2015)05-0073-02
周围神经损伤在临床上十分常见，尤其长段距离的神经缺损修复一直是困扰临床的难题，目前自体神经移植的修复方式是临床首选[1]。然而自体移植手术存在供区有限、供区感觉或运动的失神经障碍、神经束错位、神经活力随时间衰减以及无血管生成能力等问题[2-3]，也是目前临床应用无奈之举。鉴于此，本研究拟通过比较同种异体脱细胞神经支架修复大鼠坐骨神经缺损与运用自体神经移植修复的效果的差异，以期为异体脱细胞神经支架作为自体神经移植替代治疗提供部分研究基础。
, 百拇医药
1 材料与仪器
11 仪器 3131型CO2培养箱(美国Thermo公司)；H-7650型透射电镜(日本日立公司)；荧光显微镜DM4000(德国Leica公司)。手术器械及显微手术器械(宁波成和医疗器械有限公司)。
12 材料 清洁级雄性SD大鼠，体重(300±42)g，购于中山大学实验动物中心；实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2011-0029，实验动物使用许可证：SYXK(粤)2011-0112。脱氧胆酸钠、Triton X-100(美国sigma公司)；其余试剂均为分析纯。
2 方法
2 1 坐骨神经取材 准备SD大鼠8只，作为制备脱细胞支架的神经供体来源，先用10%水合氯醛按10ml/kg腹膜浸润麻醉充分后，再用75%酒精溺毙大鼠，并充分浸泡消毒10分钟，将消毒后的大鼠置于超净台，无菌操作下逐层解剖双下肢至显露双侧坐骨神经，完整切取双侧坐骨神经干，8只大鼠共取出坐骨神经16条。
, 百拇医药
22 神经支架的制备 将大鼠坐骨神经干在手术显微镜下小心去除神经干周围筋膜和血管组织，并用无菌PBS缓冲液反复清洗。在常温下进行如下步骤[4-5]：①在无菌蒸馏水中静置6h；②3% TritonX-100中静置12h；③无菌蒸馏水漂洗3次，然后用无菌PBS缓冲液漂洗3次；④4%脱氧胆酸钠溶液静置12h；⑤无菌蒸馏水漂洗3次，然后无菌PBS缓冲液漂洗3次。上述步骤完成以后得到大鼠脱细胞坐骨神经支架，将该支架置于PBS缓冲液4℃保存备用。
23 动物分组与坐骨神经缺损桥接实验模型制备 模型制备：按照随机的原则将SD大鼠分为：单纯脱细胞支架对照组(A组)和自体移植组(B组)，每组16只。常规消毒术野，铺无菌巾，于后肢外侧中上1/3处做横行切口，切开皮肤约45cm剪开筋膜组织，沿肌间隙由浅入深小心的钝性分离，充分显露坐骨神干经后，快刀切取长度为15cm的坐骨神经。形成右坐骨神经干缺损动物模型，将脱细胞神经支架在10倍手术显微镜下修剪为长度15cm，植于坐骨神经干缺损处，用10-0无创缝线，两定点外膜缝合法吻合坐骨神经近端断端于神经支架近端，缝合6针，依法吻合远端断端于神经支架远端，创面充分止血，关闭创面。自体移植组以左右两侧坐骨神经干相互交换的方法进行，术中注意标记切取神经干的远近端，以便正确回植。
, 百拇医药
2 4 神经再生的组织学观察
241 HE染色 取各组支架中段石蜡包埋切片，行常规HE染色。观察再生神经中的细胞、轴突、髓鞘的形态。
242 超薄切片 透射电镜观察再生神经的超微结构的变化情况。
3 结果
3 1 一般观察 术后15个月，两组营养不良性改变均减轻，两组再生神经外观均接近正常神经组织，B组肌肉萎缩程度较A组轻，A组皮肤感觉及运动功能差于B组。术后2个月，两组营养不良性改变均减轻，自体神经移植组肌肉萎缩程度轻，对针刺的反应敏感度及运动功能恢复较好。术后6个月，神经取材前观察神经外观情况，两组神经连续性良好，与周围组织无明显粘连，无纤维神经瘤形成，移植段表面均有不同程度的血管化，A组中段较B组略细，B组形态结构基本接近正常神经组织。
, 百拇医药 32 神经支架的光镜观察 实验组和对照组的移植物段及其两端未见肉芽组织，在其横切面上移植物中段显示大量的再生神经纤维集合形成许多由束膜包绕的神经束，并有完整的外膜包裹，两组之间在光镜观察无明显差异。
3 3 神经支架的HE染色分析 由苏木素-伊红染色结果可见图1，在移植物远段神经组织横切片上，单纯脱细胞神经支架组、自体神经移植组标本均可见成束状排列的神经样组织、蓝染的细胞核、新生毛细血管及少量的纤维组织增生，说明神经纤维已经生长至远端。此外，自体神经移植组组细胞排列较为整齐，细胞核走形较为一致，单纯脱细胞神经支架组细胞分布较紊乱，细胞核走形较为混乱，说明脱细胞支架内结缔组织增生重塑现象明显。
3 4 神经的超微结构分析 由图2可见，两组神经纤维内均可见数条神经轴突纤维，轴突满布髓鞘，在轴突内可见大量微丝、微管、新生毛细血管，细胞器丰富，轴突外有髓鞘包裹，髓鞘呈类圆形或不规则形，髓鞘壁厚薄均匀，可见同心圈层，髓鞘外周均有雪旺细胞胞质，胞质内细胞器丰富，胞核基本规整。两组超微结构无十分明显的差异。
, 百拇医药
4 讨论
周围神经长距离缺损的修复一直是临床难题，自体神经移植被认为是修复周围神经缺损的金标准[5]。因自体神经来源有限以及增加了手术部位和创伤造成该神经支配区的功能障碍，常无法满足较大神经缺损或较广泛神经损伤修复的需要。近年来有实验表明[6-7]，脱细胞的同种异体天然神经支架优于其他人工制备的支架，不仅在于有较好的组织相容性，主要还在于去除有抗原性的细胞和髓鞘， 而保留了抗原性极小的基底膜作为支架引导轴突沿移植物内管向远端生长，引导宿主许旺细胞沿其内管壁向移植段迁移和增殖，避免或极大地减轻宿主的免疫排斥反，使轴突再生通过一段较长距离成为可能。同时获得以施万细胞基底膜管(SCBL)为主的神经外基质构成的三维管状支架材料。轴突再生的研究表明，SCBL是由含丰富层黏蛋白(LN)的细胞外基质组成，它能够促进宿主施万细胞向神经移植段内迁移，引导轴突沿着SCBL的内面生长[8]。, 百拇医药(刘良燚 刘凯 张景石 李木卫 王瑒)
【关键词】 神经支架；神经缺损；大鼠
【中图分类号】R745 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2015)05-0073-02
周围神经损伤在临床上十分常见，尤其长段距离的神经缺损修复一直是困扰临床的难题，目前自体神经移植的修复方式是临床首选[1]。然而自体移植手术存在供区有限、供区感觉或运动的失神经障碍、神经束错位、神经活力随时间衰减以及无血管生成能力等问题[2-3]，也是目前临床应用无奈之举。鉴于此，本研究拟通过比较同种异体脱细胞神经支架修复大鼠坐骨神经缺损与运用自体神经移植修复的效果的差异，以期为异体脱细胞神经支架作为自体神经移植替代治疗提供部分研究基础。
, 百拇医药
1 材料与仪器
11 仪器 3131型CO2培养箱(美国Thermo公司)；H-7650型透射电镜(日本日立公司)；荧光显微镜DM4000(德国Leica公司)。手术器械及显微手术器械(宁波成和医疗器械有限公司)。
12 材料 清洁级雄性SD大鼠，体重(300±42)g，购于中山大学实验动物中心；实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2011-0029，实验动物使用许可证：SYXK(粤)2011-0112。脱氧胆酸钠、Triton X-100(美国sigma公司)；其余试剂均为分析纯。
2 方法
2 1 坐骨神经取材 准备SD大鼠8只，作为制备脱细胞支架的神经供体来源，先用10%水合氯醛按10ml/kg腹膜浸润麻醉充分后，再用75%酒精溺毙大鼠，并充分浸泡消毒10分钟，将消毒后的大鼠置于超净台，无菌操作下逐层解剖双下肢至显露双侧坐骨神经，完整切取双侧坐骨神经干，8只大鼠共取出坐骨神经16条。
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22 神经支架的制备 将大鼠坐骨神经干在手术显微镜下小心去除神经干周围筋膜和血管组织，并用无菌PBS缓冲液反复清洗。在常温下进行如下步骤[4-5]：①在无菌蒸馏水中静置6h；②3% TritonX-100中静置12h；③无菌蒸馏水漂洗3次，然后用无菌PBS缓冲液漂洗3次；④4%脱氧胆酸钠溶液静置12h；⑤无菌蒸馏水漂洗3次，然后无菌PBS缓冲液漂洗3次。上述步骤完成以后得到大鼠脱细胞坐骨神经支架，将该支架置于PBS缓冲液4℃保存备用。
23 动物分组与坐骨神经缺损桥接实验模型制备 模型制备：按照随机的原则将SD大鼠分为：单纯脱细胞支架对照组(A组)和自体移植组(B组)，每组16只。常规消毒术野，铺无菌巾，于后肢外侧中上1/3处做横行切口，切开皮肤约45cm剪开筋膜组织，沿肌间隙由浅入深小心的钝性分离，充分显露坐骨神干经后，快刀切取长度为15cm的坐骨神经。形成右坐骨神经干缺损动物模型，将脱细胞神经支架在10倍手术显微镜下修剪为长度15cm，植于坐骨神经干缺损处，用10-0无创缝线，两定点外膜缝合法吻合坐骨神经近端断端于神经支架近端，缝合6针，依法吻合远端断端于神经支架远端，创面充分止血，关闭创面。自体移植组以左右两侧坐骨神经干相互交换的方法进行，术中注意标记切取神经干的远近端，以便正确回植。
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2 4 神经再生的组织学观察
241 HE染色 取各组支架中段石蜡包埋切片，行常规HE染色。观察再生神经中的细胞、轴突、髓鞘的形态。
242 超薄切片 透射电镜观察再生神经的超微结构的变化情况。
3 结果
3 1 一般观察 术后15个月，两组营养不良性改变均减轻，两组再生神经外观均接近正常神经组织，B组肌肉萎缩程度较A组轻，A组皮肤感觉及运动功能差于B组。术后2个月，两组营养不良性改变均减轻，自体神经移植组肌肉萎缩程度轻，对针刺的反应敏感度及运动功能恢复较好。术后6个月，神经取材前观察神经外观情况，两组神经连续性良好，与周围组织无明显粘连，无纤维神经瘤形成，移植段表面均有不同程度的血管化，A组中段较B组略细，B组形态结构基本接近正常神经组织。
, 百拇医药 32 神经支架的光镜观察 实验组和对照组的移植物段及其两端未见肉芽组织，在其横切面上移植物中段显示大量的再生神经纤维集合形成许多由束膜包绕的神经束，并有完整的外膜包裹，两组之间在光镜观察无明显差异。
3 3 神经支架的HE染色分析 由苏木素-伊红染色结果可见图1，在移植物远段神经组织横切片上，单纯脱细胞神经支架组、自体神经移植组标本均可见成束状排列的神经样组织、蓝染的细胞核、新生毛细血管及少量的纤维组织增生，说明神经纤维已经生长至远端。此外，自体神经移植组组细胞排列较为整齐，细胞核走形较为一致，单纯脱细胞神经支架组细胞分布较紊乱，细胞核走形较为混乱，说明脱细胞支架内结缔组织增生重塑现象明显。
3 4 神经的超微结构分析 由图2可见，两组神经纤维内均可见数条神经轴突纤维，轴突满布髓鞘，在轴突内可见大量微丝、微管、新生毛细血管，细胞器丰富，轴突外有髓鞘包裹，髓鞘呈类圆形或不规则形，髓鞘壁厚薄均匀，可见同心圈层，髓鞘外周均有雪旺细胞胞质，胞质内细胞器丰富，胞核基本规整。两组超微结构无十分明显的差异。
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4 讨论
周围神经长距离缺损的修复一直是临床难题，自体神经移植被认为是修复周围神经缺损的金标准[5]。因自体神经来源有限以及增加了手术部位和创伤造成该神经支配区的功能障碍，常无法满足较大神经缺损或较广泛神经损伤修复的需要。近年来有实验表明[6-7]，脱细胞的同种异体天然神经支架优于其他人工制备的支架，不仅在于有较好的组织相容性，主要还在于去除有抗原性的细胞和髓鞘， 而保留了抗原性极小的基底膜作为支架引导轴突沿移植物内管向远端生长，引导宿主许旺细胞沿其内管壁向移植段迁移和增殖，避免或极大地减轻宿主的免疫排斥反，使轴突再生通过一段较长距离成为可能。同时获得以施万细胞基底膜管(SCBL)为主的神经外基质构成的三维管状支架材料。轴突再生的研究表明，SCBL是由含丰富层黏蛋白(LN)的细胞外基质组成，它能够促进宿主施万细胞向神经移植段内迁移，引导轴突沿着SCBL的内面生长[8]。, 百拇医药(刘良燚 刘凯 张景石 李木卫 王瑒)