复方甲苯咪唑乳膏微生物限度检查方法的研究(1)
【摘 要】 目的：建立复方甲苯咪唑乳膏的微生物限度检查方法。方法：按《中国药典》2015年版第三部通则非无菌微生物限度检查法规定的常规法进行验证。结果：铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌以常规法验证回收率均大于70%，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌菌液对照组和试验组生长良好。结论：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数采用常规的平皿倾注法，控制菌的检查采用常规法。
【关键词】 复方甲苯咪唑乳膏；微生物限度检验法；药品检验
【中图分类号】R286.0 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2016)11-0012-02
复方甲苯咪唑乳膏用于驱除蛔虫、蛲虫，其主要成分为盐酸左旋咪唑和甲苯咪唑。为了保证所采用的检验方法适合于该药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数以及控制菌的检查，确认供试液制备、测定方法及检测系统适用于该药品的检验。研究参照《中国药典》[1]2015年版第三部通则“1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”以及“1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”、《中国药品检验标准操作规范》[2]，建立复方甲苯咪唑乳膏微生物限度检验方法，并进行方法适用性试验，现报道如下。
1 仪器与材料
1.1 试验环境 根据2015年版《中国药典》第三部“9203药品微生物质量管理原则”[3]规定，试验在环境洁净度B级、局部洁净度A级的单向流空气的无菌室进行，阳性菌操作在符合国家Ⅱ级生物安全标准的生物安全柜内进行。
1.2 仪器 BHC-1300ⅡA2型生物安全柜(苏州苏净仪器自控设备有限公司)；GHP-9162型电热恒温培养箱(上海金慧科电子有限公司)；MJX-160B-Z型微电脑霉菌培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；DYX-DHS型隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；YXQ-LS-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器(上海市博讯实业有限公司医疗设备厂)；TZQ-Ⅱ型匀质器型号(天津市津德实验仪器技术开发中心)。
1.3 材料 复方甲苯咪唑乳膏(批号：160101、160102、160103，宿州亿帆药业有限公司)，0.1%无菌吐温溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(自配)，胰酪大豆胨液体培养基(TSB，批号：20151210-00)、胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA，批号：20160111-00)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA，批号：20151110-00)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号：20150716-00)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号：20151026-00)、沙氏葡萄糖液体培养基(SDB，批号：20151112-00)等均由杭州微生物试剂有限公司提供。
1.4 试验菌种 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10 104]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63 501]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98 003]等由中国医学菌种保藏中心和中国药品生物制品检定所提供，试验用菌株的传代次数为3代。
2 方法与结果
2.1 菌悬液的制备及菌悬液菌落数的检查
2.1.1 菌悬液的制备 取经35℃培养18～24h的铜绿假单胞菌的TSB培养物1ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-6备用，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌用同样方法分别稀释至10-5和10-8备用，取经25℃培养2～3天的白色念珠菌的SDB培养物1ml，用上述方法稀释至10-5，备用；取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加4mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-6，备用。
2.1.2 菌悬液中菌落数的检查 取“2.1.1”铜绿假单胞菌10-6级菌悬液、枯草芽孢杆菌10-5级菌悬液、金黄色葡萄球菌10-8级菌悬液各0.1ml，分别用已灭菌的45℃胰酪大豆胨琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿；取2.1.3白色念珠菌10-5级菌悬液、黑曲霉10-6孢子菌悬液各0.1ml，分别用已灭菌的45℃胰酪大豆胨琼脂培养基和已灭菌的45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，按《中国药典》2015年版规定温度培养一定时间，计数，均应不大于100cfu/ml；实测结果见表1，符合要求。
2.2 供试液制备 取本品最小包装两支(10g/支)，按微生物限度检查法规定称取10g，加40℃无菌0.1%吐温溶液至100ml，匀浆仪2000转/min，3min混匀，即为1∶[KG-*2]10的供试品溶液。
2.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的适用性试验
2.3.1 采用常规法(即平皿倾注法) 进行3次独立的平行试验。
2.3.1.1 试验组 取5支装有1∶[KG-*2]10供试液的试管，分别加“2.1.1”试验菌液0.1ml，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu，分别取上述试验液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，立即注入20ml温度不超过45℃熔化的无菌胰酪大豆胨琼脂培养基或无菌沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后置规定温度培养3～5d，逐日观察结果并记录。
2.3.1.2 菌液对照组 取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按试验组操作。
2.3.1.3 供试品对照组 取“2.2”制备好的供试液，以无菌0.1%吐温溶液代替菌液同试验组操作。, http://www.100md.com(郭秀秀)
【关键词】 复方甲苯咪唑乳膏；微生物限度检验法；药品检验
【中图分类号】R286.0 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2016)11-0012-02
复方甲苯咪唑乳膏用于驱除蛔虫、蛲虫，其主要成分为盐酸左旋咪唑和甲苯咪唑。为了保证所采用的检验方法适合于该药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数以及控制菌的检查，确认供试液制备、测定方法及检测系统适用于该药品的检验。研究参照《中国药典》[1]2015年版第三部通则“1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法”以及“1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法”、《中国药品检验标准操作规范》[2]，建立复方甲苯咪唑乳膏微生物限度检验方法，并进行方法适用性试验，现报道如下。
1 仪器与材料
1.1 试验环境 根据2015年版《中国药典》第三部“9203药品微生物质量管理原则”[3]规定，试验在环境洁净度B级、局部洁净度A级的单向流空气的无菌室进行，阳性菌操作在符合国家Ⅱ级生物安全标准的生物安全柜内进行。
1.2 仪器 BHC-1300ⅡA2型生物安全柜(苏州苏净仪器自控设备有限公司)；GHP-9162型电热恒温培养箱(上海金慧科电子有限公司)；MJX-160B-Z型微电脑霉菌培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；DYX-DHS型隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；YXQ-LS-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器(上海市博讯实业有限公司医疗设备厂)；TZQ-Ⅱ型匀质器型号(天津市津德实验仪器技术开发中心)。
1.3 材料 复方甲苯咪唑乳膏(批号：160101、160102、160103，宿州亿帆药业有限公司)，0.1%无菌吐温溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(自配)，胰酪大豆胨液体培养基(TSB，批号：20151210-00)、胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA，批号：20160111-00)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA，批号：20151110-00)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号：20150716-00)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号：20151026-00)、沙氏葡萄糖液体培养基(SDB，批号：20151112-00)等均由杭州微生物试剂有限公司提供。
1.4 试验菌种 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B) 10 104]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B) 63 501]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B) 26 003]、白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F) 98 001]、黑曲霉(Aspergillus niger)[CMCC(F) 98 003]等由中国医学菌种保藏中心和中国药品生物制品检定所提供，试验用菌株的传代次数为3代。
2 方法与结果
2.1 菌悬液的制备及菌悬液菌落数的检查
2.1.1 菌悬液的制备 取经35℃培养18～24h的铜绿假单胞菌的TSB培养物1ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-6备用，枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌用同样方法分别稀释至10-5和10-8备用，取经25℃培养2～3天的白色念珠菌的SDB培养物1ml，用上述方法稀释至10-5，备用；取经25℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加4mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-6，备用。
2.1.2 菌悬液中菌落数的检查 取“2.1.1”铜绿假单胞菌10-6级菌悬液、枯草芽孢杆菌10-5级菌悬液、金黄色葡萄球菌10-8级菌悬液各0.1ml，分别用已灭菌的45℃胰酪大豆胨琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿；取2.1.3白色念珠菌10-5级菌悬液、黑曲霉10-6孢子菌悬液各0.1ml，分别用已灭菌的45℃胰酪大豆胨琼脂培养基和已灭菌的45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml注皿，各平行测定两皿，按《中国药典》2015年版规定温度培养一定时间，计数，均应不大于100cfu/ml；实测结果见表1，符合要求。
2.2 供试液制备 取本品最小包装两支(10g/支)，按微生物限度检查法规定称取10g，加40℃无菌0.1%吐温溶液至100ml，匀浆仪2000转/min，3min混匀，即为1∶[KG-*2]10的供试品溶液。
2.3 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的适用性试验
2.3.1 采用常规法(即平皿倾注法) 进行3次独立的平行试验。
2.3.1.1 试验组 取5支装有1∶[KG-*2]10供试液的试管，分别加“2.1.1”试验菌液0.1ml，使每1ml供试液中含菌量不大于100cfu，分别取上述试验液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，立即注入20ml温度不超过45℃熔化的无菌胰酪大豆胨琼脂培养基或无菌沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后置规定温度培养3～5d，逐日观察结果并记录。
2.3.1.2 菌液对照组 取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液，按试验组操作。
2.3.1.3 供试品对照组 取“2.2”制备好的供试液，以无菌0.1%吐温溶液代替菌液同试验组操作。, http://www.100md.com(郭秀秀)