人参多糖对NK92—MI细胞杀伤活性的影响及机制(1)
【摘 要】 目的：研究人参多糖对NK92-MI杀伤活性的影响及机制。方法：采用200mg/L或400mg/L GPS作用于NK92-MI细胞，24h后收集细胞，采用CCK-8 试剂盒检测GPS对NK92-MI细胞杀伤活性和增殖活性的影响；采用流式细胞术检测GPS对NK92-MI细胞活化受体(NKp30、NKp44、NKp46、NKG2D)表达的影响；采用western blot技术检测NK细胞杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)表达水平。结果：与正常对照组相比，GPS可明显促进NK细胞杀伤活性，上调活化受体(NKp30、NKp44、NKp46)、杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的表达水平(P<0.05)。结论：GPS通过上调活化受体(NKp30、NKp44、NKp46)的表达促进NK92-MI细胞的活化，并且通过上调杀伤介质(穿孔素和颗粒酶B)的表达提高NK92-MI细胞的杀伤活性。
【关键词】 人参多糖；NK92-MI细胞；杀伤活性
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2017)09-0037-04
Effects of ginseng polysaccharides(GPS) on the cytotoxicity of the NK92-MI cells
WANG Huan1 HOU Diandong1 CHEN Wenna2 GUO Shengnan2 LEI Ping1 HAN Xiaowei1 XU Ming1 GUAN Hongquan1*
1.Basic Medical College， Liaonign University of China Medical University，Shenyang 116600，China；
2. Experiment and Technology Center， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 116600，China
Abstract：Objective To research the influence and mechanism of Ginseng polysaccharides(GPS) on the cytotoxicity of the NK92-MI cells.Methods CCK8 kit was adopted to detect the cytotoxicity of NK92-MI cells， Flow cytometric analysis was adopted to detect the expression of activated receptors， western blot was adopted to detect the expression level of perforin and Granzyme B.Results Compare to the normal control group， GPS could increase the cytotoxicity， expression of NKp30， NKp44， NKp46， perforin and granzymeB.Conclusion GPS can increase the cytotoxicity of NK92-MI cells by increasing expression of activated receptors， perforin and granzyme B.
Keywords：GPS； NK92-MI Cells； Cytotoxicity
人参多糖(Ginseng Polysaccharides，GPS)是中药人参的主要活性成分之一，是一种高分子葡聚糖，主要由人参淀粉和人参果胶两部分组成[1]。研究发现GPS具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、造血调控、抗疲劳和抗抑郁等作用，其中免疫调节活性尤为受重视[2]。前期的研究结果表明，GPS可明显提高免疫抑制小鼠NK细胞的杀伤活性[3]。其机制可能为，GPS可能通过调节机体整体免疫功能(比如调节细胞因子的水平)而促进NK细胞的杀伤功能；或GPS进入机体也可能直接对NK细胞发挥免疫调节作用。为进一步探讨GPS对NK细胞的直接活化效应及机制，采用GPS作用于NK92-MI细胞株，揭示GPS对NK细胞作用的分子机制，为进一步研究GPS的免疫调节活性提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 NK92-MI细胞株购自中科院上海细胞库。人参多糖注射液(3mg/mL)(批号：Z20025235，沈阳双鼎制药公司)；CD134(NKG2D)-FITC、CD337(NKp30)-PE、CD336(NKp44)-PerCP、CD335(NKp46)-APC购自美国eBioscience公司。anti-perforin、anti-granzyme B购自美国Santa Cruz公司；α-MEM 培养基(美国Invitrogen 公司)。马血清及胎牛血清(美国HYCLONE公司)；
1.2 方法
1.2.1 NK92-MI细胞培养 用含12.5% 胎牛血清和12.5%马血清的α-MEM培养基传代培养。
1.2.2 实验分组及细胞处理 实验组NK92-MI细胞分别以200mg/L或400mg/L GPS刺激，对照组加入等量PBS，24h后收集细胞。
1.2.3 NK92-MI细胞对K562 杀伤活性的测定 K562 细胞以10% FBS RPMI-1640 培养液常规传代培养。以对数期的K562细胞为靶细胞，各实验孔加入靶细胞100μL/孔(浓度为1×105/mL)，使效靶比分别为4∶1，同时设效应细胞对照孔、靶细胞对照孔及空白对照孔，各孔均设3个复孔。效靶细胞共同孵育4h后，每孔加入CCK-8 液(5mg/mL)20μL，再继续孵育1h。用酶標仪于450nm 处测定OD值。按下列公式计算NK-92MI 细胞对K562细胞的杀伤率： NK 细胞杀伤率(%)=[1-(杀伤实验组OD 值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100% 。, http://www.100md.com(王欢侯殿东陈文娜郭胜楠雷萍韩晓伟徐铭关洪全)
【关键词】 人参多糖；NK92-MI细胞；杀伤活性
【中图分类号】R284.2 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2017)09-0037-04
Effects of ginseng polysaccharides(GPS) on the cytotoxicity of the NK92-MI cells
WANG Huan1 HOU Diandong1 CHEN Wenna2 GUO Shengnan2 LEI Ping1 HAN Xiaowei1 XU Ming1 GUAN Hongquan1*
1.Basic Medical College， Liaonign University of China Medical University，Shenyang 116600，China；
2. Experiment and Technology Center， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 116600，China
Abstract：Objective To research the influence and mechanism of Ginseng polysaccharides(GPS) on the cytotoxicity of the NK92-MI cells.Methods CCK8 kit was adopted to detect the cytotoxicity of NK92-MI cells， Flow cytometric analysis was adopted to detect the expression of activated receptors， western blot was adopted to detect the expression level of perforin and Granzyme B.Results Compare to the normal control group， GPS could increase the cytotoxicity， expression of NKp30， NKp44， NKp46， perforin and granzymeB.Conclusion GPS can increase the cytotoxicity of NK92-MI cells by increasing expression of activated receptors， perforin and granzyme B.
Keywords：GPS； NK92-MI Cells； Cytotoxicity
人参多糖(Ginseng Polysaccharides，GPS)是中药人参的主要活性成分之一，是一种高分子葡聚糖，主要由人参淀粉和人参果胶两部分组成[1]。研究发现GPS具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、造血调控、抗疲劳和抗抑郁等作用，其中免疫调节活性尤为受重视[2]。前期的研究结果表明，GPS可明显提高免疫抑制小鼠NK细胞的杀伤活性[3]。其机制可能为，GPS可能通过调节机体整体免疫功能(比如调节细胞因子的水平)而促进NK细胞的杀伤功能；或GPS进入机体也可能直接对NK细胞发挥免疫调节作用。为进一步探讨GPS对NK细胞的直接活化效应及机制，采用GPS作用于NK92-MI细胞株，揭示GPS对NK细胞作用的分子机制，为进一步研究GPS的免疫调节活性提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料 NK92-MI细胞株购自中科院上海细胞库。人参多糖注射液(3mg/mL)(批号：Z20025235，沈阳双鼎制药公司)；CD134(NKG2D)-FITC、CD337(NKp30)-PE、CD336(NKp44)-PerCP、CD335(NKp46)-APC购自美国eBioscience公司。anti-perforin、anti-granzyme B购自美国Santa Cruz公司；α-MEM 培养基(美国Invitrogen 公司)。马血清及胎牛血清(美国HYCLONE公司)；
1.2 方法
1.2.1 NK92-MI细胞培养 用含12.5% 胎牛血清和12.5%马血清的α-MEM培养基传代培养。
1.2.2 实验分组及细胞处理 实验组NK92-MI细胞分别以200mg/L或400mg/L GPS刺激，对照组加入等量PBS，24h后收集细胞。
1.2.3 NK92-MI细胞对K562 杀伤活性的测定 K562 细胞以10% FBS RPMI-1640 培养液常规传代培养。以对数期的K562细胞为靶细胞，各实验孔加入靶细胞100μL/孔(浓度为1×105/mL)，使效靶比分别为4∶1，同时设效应细胞对照孔、靶细胞对照孔及空白对照孔，各孔均设3个复孔。效靶细胞共同孵育4h后，每孔加入CCK-8 液(5mg/mL)20μL，再继续孵育1h。用酶標仪于450nm 处测定OD值。按下列公式计算NK-92MI 细胞对K562细胞的杀伤率： NK 细胞杀伤率(%)=[1-(杀伤实验组OD 值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100% 。, http://www.100md.com(王欢侯殿东陈文娜郭胜楠雷萍韩晓伟徐铭关洪全)