降糖藏药康珠甘露总黄酮口服前体脂质体的制备及质量评价(1)
【摘 要】 目的：制备降糖藏药康珠甘露总黄酮(ZYZH)口服固体前体脂质体并对其进行质量评价。方法：采用山梨醇載体沉积法ZYZH前体脂质体，以包封率为评价指标，采用单因素考察和正交试验法，优化ZYZH前体脂质体处方及制备方法及工艺，考察 ZYZH 前体脂质体的形态、粒径分布、Zeta电位及稳定性。结果：ZYZH前体脂质体的最优处方如下：药脂比 1∶10，磷脂胆固醇比 5∶1，制备温度为 40℃;所形成的前体脂质体外观饱满、致密，复水后粒径为(442.5±3.5)nm(PDI=0.177)，Zeta电位值为(-47.2±3.4 )mV，包封率为(67.5±0.1)，贮存期间(30 d)稳定性较好。结论：山梨醇载体沉积法制备的ZYZH前体脂质体工艺简单、包封率高、稳定性好，值得进一步研究。可为后期制剂学研究提供依据。
【关键词】 前体脂质体;制备方法;正交试验;包封率
【中图分类号】R943.42 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2019)15-0025-06
前藏药降糖复方(康珠甘露)是本课题组在传统民族药方剂基础上化裁而来，用于二型糖尿病治疗及心脑血管保护。康珠甘露以传统藏药俄色作为君药， 麦冬、黄芪、枸杞等为臣药，前期研究表明，俄色中的黄酮类化合物有明显的降脂降糖作用，麦冬、黄芪、枸杞等是常用的中药材，其中的多糖、皂苷、黄酮等有提高人体免疫力， 降低血脂血糖等多种作用[1-3]。康珠甘露总黄酮提取物(ZYZH)为其主要药效成分，ZYH为其中一种主要黄酮苷成分，为其指标和主要有效成分。其作用机制为对胰岛β细胞的保护作用[4-6];增加胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗及相关代谢紊乱[7-8]。
降糖藏药康珠甘露总黄酮水溶性差，口服具有首过效应，如何提高黄酮苷类天然药物的生物利用度，一直是药剂学领域的一个难题，为了提高其口服生物利用度，故本实验采用前体脂质体技术制备了一种新型的口服ZYZH固体前体脂质体给药系统，以提高ZYZH的生物利用度。前体脂质体在运输，储存的过程中比起普通脂质体有更好的稳定性，减少聚集、融合及药物渗漏。但不同制备方法制备的前体脂质体质量不同。
本实验针对ZYZH溶解度低，首过效应明显，口服生物利用度差的特点，将其制备成一种新型的前体脂质体制剂，以期不但具备脂质体的优点，并克服传统脂质体剂型贮存稳定性差的缺点。一方面可以提高药物的溶出;另一方面最终增加ZYZH总黄酮在胃肠道的跨膜吸收和口服生物利用度。因此， 采用载体沉积法[9]制备藏药康珠甘露总黄酮(ZYZH)前体脂质体 ， 并对ZYZH前体脂质体的质量进行评价。
1 材料
1.1 仪器 AL104电子分析天平，英国malvern公司;JSM-7500F 扫描电镜，日本电子株式会社;MS-2000激光粒度分析仪，英国malvern公司;SENCO-R系列旋转蒸发仪，上海申申科技有限公司;Waters2695高效液相色谱仪，美国Waters;KQ250B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;PHS-2C，上海罗素科技有限公司。
1.2 药品及试剂 ZYZH原料药，由西南民族大学少数民族药物研究所提供，含量≥60%;ZYH对照品，由西南民族大学少数民族药物研究所提供，批号20150508，经核磁和质谱鉴定，采用HPLC法测定，经面积归一化法计算纯度大于98%;山梨醇，氯化钠，乳糖，无水乙醇，磷酸缓冲盐溶液(PBS)，胆固醇，氯仿，卵磷脂，SephadexG-50，以上试剂均为分析纯，甲醇(色谱纯)，均由成都市科龙化工试剂厂提供。
2 方法与结果
2.1 ZYZH脂质体包封率测定
2.1.1 供试品溶液的制备
2.1.1.1 对照品溶液的制备 精密称取ZYH对照品0.5260 g，用甲醇溶解并定容至100 mL，再取 1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配置成浓度为0.5260 mg·mL.-1的储备液。
2.1.1.2 空白脂质体溶液的制备 取1.000 g制得的空白前体脂质体用5 mL PBS(pH 7.0)水合后，取水合后脂质体超声破膜后，取用甲醇稀释定容至25 mL过滤取滤液即得。
2.1.1.3 ZYZH脂质体溶液的制备 取1.000 g制得的ZYZH前体脂质体用5 mL PBS(pH7.0)水合后，取水合后脂质体超声破膜后，用甲醇稀释定容至25 mL过滤取滤液即得。
2.1.1.4 脂质体包封率测定 按照本实验前期所建立的SephadexG-50柱分离法，测定方法简述如下：称取一定量的SapHadexG-50(100～200 μm)，用缓冲溶液室温浸泡24 h后装柱，精密吸取一定量脂质体样品上样，控制流速在0.8～1 mL/min，用PBS洗脱，收集前10 mL含脂质体的初洗脱液(a)，另取与上样量同体积的脂质体混悬液，用10 mL PBS稀释，得未分离溶液(b)。分别取a、b溶液用无水乙醇稀释至澄明，超声破膜，进样，测定其峰面积，根据标准曲线计算浓度和含药量。a溶液测得的药物浓度记作 C包裹，b溶液测得的药物浓度记作C总。
包封率EE%=脂质体分离比(%)=C包裹/C总×100%
2.1.2 HPLC 法的建立及验证
2.1.2.1 紫外检测波长的选择 取适量ZYH对照品，用乙醇溶解，配制成对照品溶液。以无水乙醇为空白对照，用紫外分光光度计200～800 nm范围扫描测定对照品中ZYH的吸光度。可知ZYH在285 nm附近有最大吸收值，将 HPLC 的检测波长定位285 nm。
2.1.2.2 色谱条件 色谱柱：Dikama Dimonsil C18(2)， (250 mm×4.6 mm，5 μm);紫外检测波长：285 nm;流动相：甲醇∶水=2∶3;流速：0.8 mL·min.-1;柱温：30 ℃;进样量：10μL。, 百拇医药(孟达 毛羽 林灵敏 卓小月 蒋孝龙)
【关键词】 前体脂质体;制备方法;正交试验;包封率
【中图分类号】R943.42 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517(2019)15-0025-06
前藏药降糖复方(康珠甘露)是本课题组在传统民族药方剂基础上化裁而来，用于二型糖尿病治疗及心脑血管保护。康珠甘露以传统藏药俄色作为君药， 麦冬、黄芪、枸杞等为臣药，前期研究表明，俄色中的黄酮类化合物有明显的降脂降糖作用，麦冬、黄芪、枸杞等是常用的中药材，其中的多糖、皂苷、黄酮等有提高人体免疫力， 降低血脂血糖等多种作用[1-3]。康珠甘露总黄酮提取物(ZYZH)为其主要药效成分，ZYH为其中一种主要黄酮苷成分，为其指标和主要有效成分。其作用机制为对胰岛β细胞的保护作用[4-6];增加胰岛素的敏感性，改善胰岛素抵抗及相关代谢紊乱[7-8]。
降糖藏药康珠甘露总黄酮水溶性差，口服具有首过效应，如何提高黄酮苷类天然药物的生物利用度，一直是药剂学领域的一个难题，为了提高其口服生物利用度，故本实验采用前体脂质体技术制备了一种新型的口服ZYZH固体前体脂质体给药系统，以提高ZYZH的生物利用度。前体脂质体在运输，储存的过程中比起普通脂质体有更好的稳定性，减少聚集、融合及药物渗漏。但不同制备方法制备的前体脂质体质量不同。
本实验针对ZYZH溶解度低，首过效应明显，口服生物利用度差的特点，将其制备成一种新型的前体脂质体制剂，以期不但具备脂质体的优点，并克服传统脂质体剂型贮存稳定性差的缺点。一方面可以提高药物的溶出;另一方面最终增加ZYZH总黄酮在胃肠道的跨膜吸收和口服生物利用度。因此， 采用载体沉积法[9]制备藏药康珠甘露总黄酮(ZYZH)前体脂质体 ， 并对ZYZH前体脂质体的质量进行评价。
1 材料
1.1 仪器 AL104电子分析天平，英国malvern公司;JSM-7500F 扫描电镜，日本电子株式会社;MS-2000激光粒度分析仪，英国malvern公司;SENCO-R系列旋转蒸发仪，上海申申科技有限公司;Waters2695高效液相色谱仪，美国Waters;KQ250B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;PHS-2C，上海罗素科技有限公司。
1.2 药品及试剂 ZYZH原料药，由西南民族大学少数民族药物研究所提供，含量≥60%;ZYH对照品，由西南民族大学少数民族药物研究所提供，批号20150508，经核磁和质谱鉴定，采用HPLC法测定，经面积归一化法计算纯度大于98%;山梨醇，氯化钠，乳糖，无水乙醇，磷酸缓冲盐溶液(PBS)，胆固醇，氯仿，卵磷脂，SephadexG-50，以上试剂均为分析纯，甲醇(色谱纯)，均由成都市科龙化工试剂厂提供。
2 方法与结果
2.1 ZYZH脂质体包封率测定
2.1.1 供试品溶液的制备
2.1.1.1 对照品溶液的制备 精密称取ZYH对照品0.5260 g，用甲醇溶解并定容至100 mL，再取 1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，配置成浓度为0.5260 mg·mL.-1的储备液。
2.1.1.2 空白脂质体溶液的制备 取1.000 g制得的空白前体脂质体用5 mL PBS(pH 7.0)水合后，取水合后脂质体超声破膜后，取用甲醇稀释定容至25 mL过滤取滤液即得。
2.1.1.3 ZYZH脂质体溶液的制备 取1.000 g制得的ZYZH前体脂质体用5 mL PBS(pH7.0)水合后，取水合后脂质体超声破膜后，用甲醇稀释定容至25 mL过滤取滤液即得。
2.1.1.4 脂质体包封率测定 按照本实验前期所建立的SephadexG-50柱分离法，测定方法简述如下：称取一定量的SapHadexG-50(100～200 μm)，用缓冲溶液室温浸泡24 h后装柱，精密吸取一定量脂质体样品上样，控制流速在0.8～1 mL/min，用PBS洗脱，收集前10 mL含脂质体的初洗脱液(a)，另取与上样量同体积的脂质体混悬液，用10 mL PBS稀释，得未分离溶液(b)。分别取a、b溶液用无水乙醇稀释至澄明，超声破膜，进样，测定其峰面积，根据标准曲线计算浓度和含药量。a溶液测得的药物浓度记作 C包裹，b溶液测得的药物浓度记作C总。
包封率EE%=脂质体分离比(%)=C包裹/C总×100%
2.1.2 HPLC 法的建立及验证
2.1.2.1 紫外检测波长的选择 取适量ZYH对照品，用乙醇溶解，配制成对照品溶液。以无水乙醇为空白对照，用紫外分光光度计200～800 nm范围扫描测定对照品中ZYH的吸光度。可知ZYH在285 nm附近有最大吸收值，将 HPLC 的检测波长定位285 nm。
2.1.2.2 色谱条件 色谱柱：Dikama Dimonsil C18(2)， (250 mm×4.6 mm，5 μm);紫外检测波长：285 nm;流动相：甲醇∶水=2∶3;流速：0.8 mL·min.-1;柱温：30 ℃;进样量：10μL。, 百拇医药(孟达 毛羽 林灵敏 卓小月 蒋孝龙)