宋晓聪,杨芳芳,胡 丹,曲 彦

    热休克蛋白 (heat shock proteins,HSPs)是生物体或离体培养细胞在热应激等不良环境下由热休克基因编码产生的一组具有高度保守性的应激蛋白,广泛存在于原核细胞和真核细胞中。在热休克蛋白家族中,热休克蛋白 70(heat shock protein 70,HSP70)家族是最保守、最丰富,也是研究最为深入的一种[1]。在脑卒中、颅脑创伤等所致的脑缺血再灌注过程中,脑缺血缺氧引起的氧化应激反应所产生的大量氧自由基是引起脑损伤的主要原因之一[2]。目前,如何保护神经组织免受氧化应激损伤成为医学研究的一个重要课题。本实验以重组腺病毒介导外源性 HSP70在体外培养的神经元和胶质细胞中表达,再以过氧化氢 (H2O2)诱导细胞损伤作为细胞氧化应激损伤的模型,观察外源性 HSP70表达对 H2O2所致神经元和胶质细胞毒性的影响,以探讨 HSP70是否具有抗氧化的神经保护作用。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料和试剂 重组腺病毒 vAd-HSP70和腺病毒载体对照 vAd-GFP由本课题组构建并保存[3]。乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒购于南京建成科技有限公司;鼠抗人HSP70单克隆抗体购于美国 Santa Cruz生物技术公司;辣根过氧化物酶标记羊抗鼠 IgG和羊抗兔 IgG购于北京博奥森生物技术有限公司。

    1.2 体外神经元和胶质细胞的培养 取出生时间 <24 h的新生昆明种小鼠 (购自青岛市药品检验所),在无菌条件下断头取大脑皮质,去除软脑膜,剪碎皮质,经消化、离心,加培养液制成细胞悬液,接种于 75 cm2培养瓶,置 37℃,5%CO2培养箱中培养。具体过程参见文献 [4]。靶细胞主要为神经元和胶质细胞。

    1.3 感染靶细胞及氧化应激模型的建立

    1.3.1 实验分组 对照组包括正常细胞对照组 (未感染组)和腺病毒对照组 (vAd-GFP感染组);实验组为重组腺病毒vAd-HSP70感染组。病毒感染组在感染 48 h时经 0.5 mol/L H2O2处理,同时未感染组也给予氧化应激处理。

    1.3.2 感染靶细胞 体外培养神经元和胶质细胞达 70%～80%融合时,弃去培养液,用 PBS洗细胞单层一次,接种 200 μl低温保存的重组腺病毒悬液,37℃吸附 30 min,加维持液继续培养。

    1.3.3 氧化应激模型 将 30%H2O2用无血清 DMEM稀释成终浓度为 0.5 mmol/L的处理液,现配现用。将 3组细胞在无菌条件下弃去培养液,加入配好的处理液,液体完全覆盖靶细胞作用 1 h ......