微波法提取当归中阿魏酸及HPLC测定其含量的研究
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摘要：目的：建立当归中阿魏酸的提取及含量测定方法，为当归的质量标准控制提供理论依据。方法：采用微波提取当归中阿魏酸，萃取液为80%甲醇20ml，微波萃取仅功率：为最大功率(850W)的25%；时间：恒压时间15min，总时间25min；压力值0.40MPa。采用高效液相色谱(HPLC)法测定当归中阿魏酸的含量，Hitachi 7000型高效液相色谱仪，Symmetery—C18(4.6mmX150mm，5/1m)色谱柱；拄温：35℃；流动相：乙睛一0.02tool/l磷酸=氢钾溶液(17：83，pH2.5)；流速：1.0ml/min；检测波长：322nm；进样体积20μl。结果：阿魏酸进样量在O.048～O.128μg范围内与峰面积呈良好线性关系，R=0.9998；平均回收率为100.01%，RSD＝2.41%。结论：本实验所建立的方法专属性强，准确度高，重现性好，可作为当归的质量控制方法。
关键词：HPLC 当归 阿魏酸
【中图分类号】R31 【文献标识码】A 【文章编号】1008—1879(2010)02—0011—02
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当归[Angelilea sinensis(oliv)Diels]为伞形科当归属一种多年生草本植物，是我国常用的中药之一，有活血化淤、养血调经、镇静、镇痛等功效，为妇科良药。阿魏酸为当归中的活性成分，具有较强的生理活性，有抑制胶原和ADP诱导的血小板聚集，补血养血和提高免疫力等作用，对脑细胞和血细胞减少有较好的疗效。目前，当归中阿魏酸的提取及含量测定方法研究较多，但报道结果差异较大。进一步研究该当归中阿魏酸的提取及含量测定方法可以更好的反映和控制当归的内在质量。当归中阿魏酸的提取方法主要有主要是应用冷浸过夜、超声、索式和加热回流等传统方法进行提取。因此，本文采用微波萃取并用高效液相色谱(HPLC)法测定当归中阿魏酸的含量，并进行了含量测定的方法学考察，旨在为当归的质量控制提提供理论支撑。
1 仪器和试药
1.1 主要仪器。Hitachi 7000型高效液相色谱仪(配有L—7420UV—VIS检测器、L—7200自动进样器)；MSP—100E微波萃取仪(北京瑞利分析仪器公司)；HANNA—pH计(MAU—RITUS)；KQ—50B型超声清洗器；FAl004型电子天平(上海精科天平仪器厂)；KS—6000超声波清洗机(宁波科声仪器厂)；ZK—82A型真塑干燥箱(上海市实验仪器总厂)；电热恒温水浴锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
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1.2试药。阿魏酸对照品(批号：0773—9910中国药品生物制品检定所)；当归由北京同仁堂大药房购得；乙睛为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。所有试剂上HPLC前均经0.45μm的微孔滤膜过滤并超声脱气。
2 方法与结果
2.1 标准品溶液的制备。精密称取阿魏酸对照品15.00 mg于15 ml的容量瓶中，用甲醇—1%冰醋酸(50：50)溶解，并稀释至刻度，摇匀，配成浓度为1.00 mg/ml的标准溶液，放入冰箱贮存，备用。
2.2样品溶液的制备。精密称取当归粉末0.2g，置于微波萃取罐中，量取80%甲醇20ml，称定重量，密封。微波萃取仪功率：为最大功率(850W)的25%；时间：恒压时间15min，总时间25min；压力值0.40MPa。微波萃取后冷却至室温，补重，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。
, 百拇医药 2.3色谱条件与系统适用性试验。采用Symmetery—C18(4.6mmx150mm，5μm)色谱柱；柱温：35*(2；流动相：乙晴—0.02too1/1磷酸二氢钾溶液(17：83，pH2.5)；流速：1.0ml/min；检测波长：322nm；进样体积20μl。在此色谱条件下，阿魏酸与其它组分能达到基线分离。
2.4方法学考察。
2.4.1线性关系考察。精密吸取上述对标准品溶液40μl于5ml容量瓶中，加甲醇—1%冰醋酸(50：50)稀释至刻度，摇匀，精密吸取上述溶液各6、8、10、12、14、16μ1，分别注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以阿魏酸进样量(“g)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行回归分析，得回归方程：Y二一54944.1+3.392X106X，R＝0.9998，表明阿魏酸在0.048～0.128μg内具有良好的线性关系。
2.4.2精密度实验。精密吸取标准品溶液20μ1，重复进样5次，结果阿魏酸峰面积的RSD＝1.21%(n＝5)，表明仪器精密度良好。
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2.4.3稳定性实验。精密吸取同一样品溶液适量，在室温下放置，于0，2，4，8，12h分别进样，并测定峰面积。结果RSD＝1.24%(n＝5)，表明样品溶液在12 h内稳定性良好。
2.4.4重复性实验。精密称取同一样品粉末6份，每份约0.20g，按“2.2”项下方法制各样品溶液，按上述色谱条件测定，记录色谱图，计算阿魏酸含量。结果阿魏酸含量的RSD＝1.02%。表明本实验方法重现性良好。
2.4.5加样回收率试验。精密称取已知含量的本品粉末6份，每份约0.12g，分别加入阿魏酸标准品适量，按2.2项下方法制备样品溶液，按上述色谱条件测定，平均回收率为100.01%，RSD＝2.41%(n＝5)。表明本方法的回收率较好，结果见表1。
3 讨论
3.1 提取溶剂的选择。因阿魏酸易分解，传统的超声、加热回流和冷浸过夜采用含有1.0%冰醋酸的甲醇溶液提取当归中阿魏酸可抑制其分解，稳定性良好，能达到满意的测定结果，但对于微波萃取并不适合，因为微波可以使冰醋酸和甲醇发生酯化反应，所以提取时没有加入冰醋酸。在微波提取时，我们曾考查了甲醇提取液的浓度，80%甲醇提取液比100%甲醇最佳压力值高了约0.1MPa，主要原因是80%甲醇中含有20%水，故提高了其最佳压力值，随着含水量不断增加最佳压力值必然会上升。因此，在微波萃取设备正常运转前提下，在甲醇中加入一定量的水，不仅可以节约成本，还可以适当增加提取率。
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3.2 检测波长的选择。2005年版中国药典一部中HPLC测定当归药材中的阿魏酸所选检测波长为316 nmU]，本研究取阿魏酸对照品溶液用紫外进行全波长扫描测定，阿魏酸在322 nm有最大吸收。经对样品的高效液相色谱图进行对比，采用3.22 nm测定无杂质干扰，分离度符合规定要求，故选用322 nm为当归中阿魏酸的检测波长。
3.3 阿魏酸的稳定性。有研究报道阿魏酸的分解转化与其浓度有关，高浓度的对照品溶液在室温下很稳定，基本不分解，但浓度为0.0141mg/m1的阿魏酸标准品溶液测定的结果表明，放置时间越长阿魏酸分解转化就越多，分解峰的面积不断增加。因此，本实验中选择了较高浓度的对照品溶液。
3.4流动相的选择。在进行流动相的选择时，曾以乙腈—0.085%磷酸溶液(17：83)、水一冰醋酸一正丁醇(347：1：11)、甲醇一乙腈—1%冰醋酸(25：25：50)、甲醇-正丁醇—水—1%冰醋酸(20：20：70：0.5)等流动相体系进行试验，当归中的其他组分与阿魏酸不能分离，采用乙晴—0.02mol/l磷酸二氢钾溶液流动相体系，分离情况较好，最后选定乙晴—0.02mol/l磷酸二氢钾溶液(17：83)使阿魏酸与杂质峰的分离度符合规定，达到较佳的结果。
总之，通过本实验建立了当归中阿魏酸含量测定的HPLC测定方法，该法操作重复性良好，测定结果稳定可靠，因此。该方法能应用于当归的质量控制。, 百拇医药(李俊平 黄春莲 丘振文 吕玉兰)