前列腺癌相关风险位点rs1800477对前列腺癌细胞系DU145的功能研究(1)
摘要：目的：验证前期研究发现的前列腺癌相关风险位点rs1800477对前列腺癌细胞转移的影响。方法：以前列腺癌细胞DU145为对象，针对位点rs1800477构建慢病毒载体，分4组转染到DU145细胞，并进行划痕实验，比较各组的迁移率。于6h和24 h测量各组细胞迁移距离并计算迁移率。结果：与空白对照组比较野生型在6h和24h均有统计学意义，但突变型组无统计学意义。结论：野生型rsl800477对前列腺癌细胞系DU145的迁移能力有影响。
关键词：前列腺癌；DU145；风险位点；功能研究
中图分类号：R737.25
文献标志码：A
文章编号：1008-2409(2015)02-0001-04
前列腺癌已经在男性致死性疾病中跃居第2位，在美同和欧洲国家前列腺癌患者数量很大。21世纪初一项对男性前列腺癌调查研究报道显示，超过90万名男性被确诊为前列腺癌，近3万人因前列腺癌而死亡。作为一种复杂形状疾病，前列腺癌不仅能累计膀胱、直肠等邻近脏器，还能侵犯骨、脑等远端脏器。有研究报道，发生了骨转移的前列腺癌其病死率明显增高。另有研究报道前列腺癌的骨转移与胰岛素样受体IGF-I和IGF-II有关，在骨组织中，该受体能够促进成骨细胞的增殖。单核苷酸多态性(SNPs)的研究表明位点突变通过与环境因素的相互作用引起相关癌症的发生。位点的突变能够引起相应基因表达的改变，从而导致癌症的发生。在笔者的前期研究中通过关联分析发现位于BCL2基因的位点rs1800477与前列腺癌存在相关关系，在本研究中用前列腺癌骨转移细胞系DU145进行划痕实验对上述结果进行验证。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料
该实验由上海吉凯基因公司负责完成。整个实验分为4个组：空白对照组(CON)：正常DU145细胞未感染任何病毒的细胞组；阴性对照组(NC)：正常DUl45细胞加阴性对照病毒感染的细胞组；野生型组(OE-wt)：正常DU145细胞加目的基因BCL2野生型病毒感染的细胞组；突变型组(OE-mu)：正常DU145细胞加目的基因BEL2突变型病毒感染的细胞组。
DU145细胞系购自中山大学。Taq polymerase(SinoBio批号E001-02B)，dNTP(Takara，批号D4030A)，胎牛血清(Gibco)，REMI Medium 1640(Gibco).限制性内切酶(NEB)，BamHI/Agel酶切(上海吉凯基因化学技术有限公司)，GV166载体(上海吉凯基因化学技术有限公司)，positive clone测序(美季生物技术，型号ABI3730)，PCR仪(Ap-plied Biosystems，美国)，细胞培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，细菌摇床(华利达实验设备公司，型号HI-92IIIK)，37℃，Gilson移液器(吉尔森公司)，5%CO2恒温培养箱(CEDCO)。
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1.2 过表达慢病毒载体的构建
1.2.1 载体酶切 基因信息：基因名称为BCI_2(NM-000633)，物种为Human。载体信息：①载体名称：GV166。②元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-IRES-puro。③克隆位点：BamHI/Agel。酶切反应体系：37℃，2h。试剂体积：ddH2O 42 μl；10×buffer5μl；纯化的DNA质粒(1g/L)2μl；Agel(5U/μl)。
1.2.2 目的基因片段的获取 引物交配碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因，具体序列为：BCL2-F：aggtcgactctagag-gatcccgccaccatggcgcacgggagaac；BCL2-R：agtccatg-gtggcgaccggctgtggcccgataggcaco PCR反应体系：ddH20 12.4μ1；5×Taq buffer 4μl； dNTPs(2.5mmol/L)1.6μl；Primer(+)(lOμmol/L)0.4μl；Primer(一)(10μmol/L)0.4μI；Template(10g/L)1μI；Taq polymerase 0.2μl。PCR反应条件：94℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，1Omin；4℃，∞；30cycle。
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1.3 慢病毒的感染
①处于对数生长期的PC3细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液。②将细胞悬液(细胞数约为5×104)接种于6孔板中，37℃5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到约30%。③根据公式：MOI值一病毒量×滴度/感染细胞数，各组MOI值均为20，可计算出各组需要加入的病毒量[NC组滴度为(2E+9) TU/ml，病毒加入量2μl；OE-mu组与OE-wt组滴度均为(2E+8)TU/ml，病毒加入量20μ1]，感染条件为1640+10%FBS+5g/Lpolybrene。④12h后观察细胞状态：如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基；如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基。⑤感染3d后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况。⑥感染9d后进行细胞划痕实验，整个过程记录细胞生长状态变化。
1.4 细胞培养和处理
用含有10%胎牛血清的培养液进行常规培养，放置于37℃，5%C02的恒温培养箱。为保证细胞的正常生长，细胞液隔天进行更换。实验分为4组，①空白对照组(CON)：正常DU145细胞未感染任何病毒的细胞组。②阴性对照组(NC)：正常DU145细胞加阴性对照病毒感染的细胞组。③野生型组(OE-WT)：正常DU145细胞加目的基因BCL2野生型病毒感染的细胞组。④突变型组(OE-MU)：正常DUl45细胞加目的基因BEL2突变型病毒感染的细胞组。, 百拇医药(辛先祥 胡艳玲)
关键词：前列腺癌；DU145；风险位点；功能研究
中图分类号：R737.25
文献标志码：A
文章编号：1008-2409(2015)02-0001-04
前列腺癌已经在男性致死性疾病中跃居第2位，在美同和欧洲国家前列腺癌患者数量很大。21世纪初一项对男性前列腺癌调查研究报道显示，超过90万名男性被确诊为前列腺癌，近3万人因前列腺癌而死亡。作为一种复杂形状疾病，前列腺癌不仅能累计膀胱、直肠等邻近脏器，还能侵犯骨、脑等远端脏器。有研究报道，发生了骨转移的前列腺癌其病死率明显增高。另有研究报道前列腺癌的骨转移与胰岛素样受体IGF-I和IGF-II有关，在骨组织中，该受体能够促进成骨细胞的增殖。单核苷酸多态性(SNPs)的研究表明位点突变通过与环境因素的相互作用引起相关癌症的发生。位点的突变能够引起相应基因表达的改变，从而导致癌症的发生。在笔者的前期研究中通过关联分析发现位于BCL2基因的位点rs1800477与前列腺癌存在相关关系，在本研究中用前列腺癌骨转移细胞系DU145进行划痕实验对上述结果进行验证。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂与材料
该实验由上海吉凯基因公司负责完成。整个实验分为4个组：空白对照组(CON)：正常DU145细胞未感染任何病毒的细胞组；阴性对照组(NC)：正常DUl45细胞加阴性对照病毒感染的细胞组；野生型组(OE-wt)：正常DU145细胞加目的基因BCL2野生型病毒感染的细胞组；突变型组(OE-mu)：正常DU145细胞加目的基因BEL2突变型病毒感染的细胞组。
DU145细胞系购自中山大学。Taq polymerase(SinoBio批号E001-02B)，dNTP(Takara，批号D4030A)，胎牛血清(Gibco)，REMI Medium 1640(Gibco).限制性内切酶(NEB)，BamHI/Agel酶切(上海吉凯基因化学技术有限公司)，GV166载体(上海吉凯基因化学技术有限公司)，positive clone测序(美季生物技术，型号ABI3730)，PCR仪(Ap-plied Biosystems，美国)，细胞培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)，细菌摇床(华利达实验设备公司，型号HI-92IIIK)，37℃，Gilson移液器(吉尔森公司)，5%CO2恒温培养箱(CEDCO)。
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1.2 过表达慢病毒载体的构建
1.2.1 载体酶切 基因信息：基因名称为BCI_2(NM-000633)，物种为Human。载体信息：①载体名称：GV166。②元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-IRES-puro。③克隆位点：BamHI/Agel。酶切反应体系：37℃，2h。试剂体积：ddH2O 42 μl；10×buffer5μl；纯化的DNA质粒(1g/L)2μl；Agel(5U/μl)。
1.2.2 目的基因片段的获取 引物交配碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因，具体序列为：BCL2-F：aggtcgactctagag-gatcccgccaccatggcgcacgggagaac；BCL2-R：agtccatg-gtggcgaccggctgtggcccgataggcaco PCR反应体系：ddH20 12.4μ1；5×Taq buffer 4μl； dNTPs(2.5mmol/L)1.6μl；Primer(+)(lOμmol/L)0.4μl；Primer(一)(10μmol/L)0.4μI；Template(10g/L)1μI；Taq polymerase 0.2μl。PCR反应条件：94℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，1Omin；4℃，∞；30cycle。
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1.3 慢病毒的感染
①处于对数生长期的PC3细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液。②将细胞悬液(细胞数约为5×104)接种于6孔板中，37℃5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到约30%。③根据公式：MOI值一病毒量×滴度/感染细胞数，各组MOI值均为20，可计算出各组需要加入的病毒量[NC组滴度为(2E+9) TU/ml，病毒加入量2μl；OE-mu组与OE-wt组滴度均为(2E+8)TU/ml，病毒加入量20μ1]，感染条件为1640+10%FBS+5g/Lpolybrene。④12h后观察细胞状态：如果有明显的细胞毒性作用，立即更换培养基；如果没有明显的细胞毒性作用，继续培养24h后更换培养基。⑤感染3d后观察慢病毒上报告基因GFP的表达情况。⑥感染9d后进行细胞划痕实验，整个过程记录细胞生长状态变化。
1.4 细胞培养和处理
用含有10%胎牛血清的培养液进行常规培养，放置于37℃，5%C02的恒温培养箱。为保证细胞的正常生长，细胞液隔天进行更换。实验分为4组，①空白对照组(CON)：正常DU145细胞未感染任何病毒的细胞组。②阴性对照组(NC)：正常DU145细胞加阴性对照病毒感染的细胞组。③野生型组(OE-WT)：正常DU145细胞加目的基因BCL2野生型病毒感染的细胞组。④突变型组(OE-MU)：正常DUl45细胞加目的基因BEL2突变型病毒感染的细胞组。, 百拇医药(辛先祥 胡艳玲)