HSP70敲低对AD转基因果蝇的神经保护作用(1)
摘要：目的：探讨HSP70敲低(HSP70RNAi)在阿尔茨海默病(AD)发病机制中的作用。方法：利用经典的GAL4/UAS系统，选用ninaE-GAL4启动子，将突变位点在R406W处的Tau蛋白在果蝇复眼内选择性表达，构建ninaE-GAL4/UAS系统AD转基因果蝇模型。然后观察在敲低和不敲低分子伴侣HSP70表达的情况下，HSP70在AD转基因果蝇模型中的作用。结果：HSP70RNAi明显抑制了AD转基因果蝇模型的复眼视网膜光感受神经元变性。结论：HsP70RNAi对AD转基因果蝇模型具有神经保护作用。
关键词：阿尔茨海默病；Tau；HSP70；果蝇
中图分类号：Q969.462.2 文献标志码：A 文章编号：1008—2409(2015)04—0001—04
AD是一种年龄相关的、不断进展的神经退行性突病，以记忆障碍和多重认知损害为特征。随着人类寿命的增长，AD可能成为人类健康的焦点，给个人及家庭带来了负担。AD患者大脑的组织病理学研究表明，突触丢失、线粒体异常和炎性反应是其特征性表现，除此之外还有分布在大脑学习和记忆区的细胞外的淀粉样(AB)蛋白及细胞内TAU蛋白过度磷酸化所致的神经纤维缠结(NFTs)。过度磷酸化的TAU蛋白在AD中更容易聚集，因此，降低这些TAU蛋白的水平成为治疗AD的有期望的途径。TAU蛋白的稳态通常是由分子伴侣来调控，如热休克蛋白70。因其调节TAU蛋白稳态方面潜在的治疗作用，HSP70引起了越来越多研究者的重视。细胞模型中，HSPT0的ATP酶活性抑制剂可以促进TAU蛋白的逆转和恢复它的稳定。第一代HSP70抑制剂，如亚甲蓝(MB)，能提高TAU蛋白病小鼠模型的学习和记忆能力。本研究探讨HSP70RNAi对AD的作用，采用遗传干预使HSP70RNAi在ninaE-GAIA/UAS系统的AD转基因果蝇模型视网膜光感受神经元中表达，观察HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型是否具有保护作用。
1材料与方法
1.1材料
果蝇品系：w1118、ninaE-GAL4购自美国Bloomington果蝇中心；模型UAS-hTauR406W购自美国哈佛大学；双平衡系果蝇sco/CyO；TM3/TM6由中南大学医学遗传学国家重点实验室惠赠；HSP70RNAi由清华大学惠赠。
1.2方法
1.2.1果蝇杂交
1.2.1.1构建w1118/+；ninaE-GALA/+的果蝇
将w1118的处女蝇与ninaE-GAIA的雄性果蝇杂交，收取F1代，即基因型为wlll8/+；ninaE-GAIA/+的目的果蝇。即正常对照果蝇。
1.2.1.2构建ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/+的果蝇将ninaE-GAIA处女蝇与UAS-hTauR406W雄性果蝇杂交即得到ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/+果蝇。
1.2.1.3构建HSP70RNAi对AD转基因模型干预的果蝇将ninaE-GAIA处女蝇与sco/CyO；TM3/TM6雄性果蝇杂交，构建基因型为ninaE-GAL4/sco；+/TM3的果蝇；同时将UAS-hTauR406W处女蝇与sco/CyO；TM3/TM6雄性果蝇杂交，构建基因型为+/CyO；UAS-hTauR406W/TM6的果蝇；再将ninaE-GAIA/sco；+/TM3的处女蝇与+/CyO；UAS-hTauR406W/TM6雄性果蝇杂交，筛选卷翅且短刚毛的子代，即基因型为ninaE-GAIA/CyO；UAS-hTauR406W/TM3的目的果蝇。再将HSP70RNAi的处女蝇与ninaE-GAIA/CyO；UAS-hTauR406W/TM3的雄性果蝇杂交，筛选基因型为ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi的目的果蝇。即ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi的果蝇。
1.2.2数据采集
1.2.2.1观察果蝇复眼形态并拍照 用奥林巴斯体视显微镜观察第7天的雄性目的果蝇复眼结构。
1.2.2.2应用试剂盒检测线粒体三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)浓度取第7天的w1118/+；ninaE-GAL4/+果蝇(正常对照组)，ninaE-GAL4/+；UAS-hTauR406W/+果蝇(疾病模组)，ninaE-GAL4/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi果蝇(基因干预组)各10只雄性果蝇，切取果蝇头部；分别将果蝇加入0.1 LATP反应液中进行研磨，充分反应后调离心机转速为10 000 r/min离心15 min，分别取出0.01 L上清液加入96孔板后，再分别加入0.09 LATP反应液；将标准品按一定的浓度梯度稀释，并加入96孔板；室温避光反应15 min后，酶标仪测定OD值；减去本底发光值，制作标准曲线；根据标准曲线计算ATP浓度，计算ATP浓度与正常对照组的百分比。
1.3统计学处理
采用SPSS 18.0统计软件进行分析，用t检验。
2结果
2.1 AD转基因果蝇模型
为鉴定AD转基因果蝇模型，本研究分别从果蝇表型、果蝇ATP分析比较正常对照组与AD转基因果蝇模型。结果显示。AD转基因果蝇模型复眼表面粗糙凹凸不平，面积较正常果蝇明显减小，色素沉着减少。详见图1。AD转基因果蝇模型与正常对照组相比较，其ATP明显降低，t=10.544 P<0.01。详见图2。
2.2 HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型的影响
为了探讨HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型是否有保护作用，本研究从果蝇表型、果蝇ATP分析HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型的影响。结果显示HSP70RNAi对疾病模型干预后，果蝇复眼较疾病组呈现明显的好转，复眼表面光整，复眼面积稍增大，色素沉着加深。详见图3。ATP水平升高，t=-6.653，P<0.01。详见图4。, 百拇医药(顾凤鸣 李清华 刘开祥 郭丰宁 陈梅玲 曾爱源)
关键词：阿尔茨海默病；Tau；HSP70；果蝇
中图分类号：Q969.462.2 文献标志码：A 文章编号：1008—2409(2015)04—0001—04
AD是一种年龄相关的、不断进展的神经退行性突病，以记忆障碍和多重认知损害为特征。随着人类寿命的增长，AD可能成为人类健康的焦点，给个人及家庭带来了负担。AD患者大脑的组织病理学研究表明，突触丢失、线粒体异常和炎性反应是其特征性表现，除此之外还有分布在大脑学习和记忆区的细胞外的淀粉样(AB)蛋白及细胞内TAU蛋白过度磷酸化所致的神经纤维缠结(NFTs)。过度磷酸化的TAU蛋白在AD中更容易聚集，因此，降低这些TAU蛋白的水平成为治疗AD的有期望的途径。TAU蛋白的稳态通常是由分子伴侣来调控，如热休克蛋白70。因其调节TAU蛋白稳态方面潜在的治疗作用，HSP70引起了越来越多研究者的重视。细胞模型中，HSPT0的ATP酶活性抑制剂可以促进TAU蛋白的逆转和恢复它的稳定。第一代HSP70抑制剂，如亚甲蓝(MB)，能提高TAU蛋白病小鼠模型的学习和记忆能力。本研究探讨HSP70RNAi对AD的作用，采用遗传干预使HSP70RNAi在ninaE-GAIA/UAS系统的AD转基因果蝇模型视网膜光感受神经元中表达，观察HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型是否具有保护作用。
1材料与方法
1.1材料
果蝇品系：w1118、ninaE-GAL4购自美国Bloomington果蝇中心；模型UAS-hTauR406W购自美国哈佛大学；双平衡系果蝇sco/CyO；TM3/TM6由中南大学医学遗传学国家重点实验室惠赠；HSP70RNAi由清华大学惠赠。
1.2方法
1.2.1果蝇杂交
1.2.1.1构建w1118/+；ninaE-GALA/+的果蝇
将w1118的处女蝇与ninaE-GAIA的雄性果蝇杂交，收取F1代，即基因型为wlll8/+；ninaE-GAIA/+的目的果蝇。即正常对照果蝇。
1.2.1.2构建ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/+的果蝇将ninaE-GAIA处女蝇与UAS-hTauR406W雄性果蝇杂交即得到ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/+果蝇。
1.2.1.3构建HSP70RNAi对AD转基因模型干预的果蝇将ninaE-GAIA处女蝇与sco/CyO；TM3/TM6雄性果蝇杂交，构建基因型为ninaE-GAL4/sco；+/TM3的果蝇；同时将UAS-hTauR406W处女蝇与sco/CyO；TM3/TM6雄性果蝇杂交，构建基因型为+/CyO；UAS-hTauR406W/TM6的果蝇；再将ninaE-GAIA/sco；+/TM3的处女蝇与+/CyO；UAS-hTauR406W/TM6雄性果蝇杂交，筛选卷翅且短刚毛的子代，即基因型为ninaE-GAIA/CyO；UAS-hTauR406W/TM3的目的果蝇。再将HSP70RNAi的处女蝇与ninaE-GAIA/CyO；UAS-hTauR406W/TM3的雄性果蝇杂交，筛选基因型为ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi的目的果蝇。即ninaE-GAIA/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi的果蝇。
1.2.2数据采集
1.2.2.1观察果蝇复眼形态并拍照 用奥林巴斯体视显微镜观察第7天的雄性目的果蝇复眼结构。
1.2.2.2应用试剂盒检测线粒体三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)浓度取第7天的w1118/+；ninaE-GAL4/+果蝇(正常对照组)，ninaE-GAL4/+；UAS-hTauR406W/+果蝇(疾病模组)，ninaE-GAL4/+；UAS-hTauR406W/HSP70RNAi果蝇(基因干预组)各10只雄性果蝇，切取果蝇头部；分别将果蝇加入0.1 LATP反应液中进行研磨，充分反应后调离心机转速为10 000 r/min离心15 min，分别取出0.01 L上清液加入96孔板后，再分别加入0.09 LATP反应液；将标准品按一定的浓度梯度稀释，并加入96孔板；室温避光反应15 min后，酶标仪测定OD值；减去本底发光值，制作标准曲线；根据标准曲线计算ATP浓度，计算ATP浓度与正常对照组的百分比。
1.3统计学处理
采用SPSS 18.0统计软件进行分析，用t检验。
2结果
2.1 AD转基因果蝇模型
为鉴定AD转基因果蝇模型，本研究分别从果蝇表型、果蝇ATP分析比较正常对照组与AD转基因果蝇模型。结果显示。AD转基因果蝇模型复眼表面粗糙凹凸不平，面积较正常果蝇明显减小，色素沉着减少。详见图1。AD转基因果蝇模型与正常对照组相比较，其ATP明显降低，t=10.544 P<0.01。详见图2。
2.2 HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型的影响
为了探讨HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型是否有保护作用，本研究从果蝇表型、果蝇ATP分析HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型的影响。结果显示HSP70RNAi对疾病模型干预后，果蝇复眼较疾病组呈现明显的好转，复眼表面光整，复眼面积稍增大，色素沉着加深。详见图3。ATP水平升高，t=-6.653，P<0.01。详见图4。, 百拇医药(顾凤鸣 李清华 刘开祥 郭丰宁 陈梅玲 曾爱源)