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编号:12957504
HSP70敲低对AD转基因果蝇的神经保护作用(1)
http://www.100md.com 2016年8月1日 《华夏医学》 2016年第4期
     摘要:目的:探讨HSP70敲低(HSP70RNAi)在阿尔茨海默病(AD)发病机制中的作用。方法:利用经典的GAL4/UAS系统,选用ninaE-GAL4启动子,将突变位点在R406W处的Tau蛋白在果蝇复眼内选择性表达,构建ninaE-GAL4/UAS系统AD转基因果蝇模型。然后观察在敲低和不敲低分子伴侣HSP70表达的情况下,HSP70在AD转基因果蝇模型中的作用。结果:HSP70RNAi明显抑制了AD转基因果蝇模型的复眼视网膜光感受神经元变性。结论:HsP70RNAi对AD转基因果蝇模型具有神经保护作用。

    关键词:阿尔茨海默病;Tau;HSP70;果蝇

    中图分类号:Q969.462.2 文献标志码:A 文章编号:1008—2409(2015)04—0001—04

    AD是一种年龄相关的、不断进展的神经退行性突病,以记忆障碍和多重认知损害为特征。随着人类寿命的增长,AD可能成为人类健康的焦点,给个人及家庭带来了负担。AD患者大脑的组织病理学研究表明,突触丢失、线粒体异常和炎性反应是其特征性表现,除此之外还有分布在大脑学习和记忆区的细胞外的淀粉样(AB)蛋白及细胞内TAU蛋白过度磷酸化所致的神经纤维缠结(NFTs)。过度磷酸化的TAU蛋白在AD中更容易聚集,因此,降低这些TAU蛋白的水平成为治疗AD的有期望的途径。TAU蛋白的稳态通常是由分子伴侣来调控,如热休克蛋白70。因其调节TAU蛋白稳态方面潜在的治疗作用,HSP70引起了越来越多研究者的重视。细胞模型中,HSPT0的ATP酶活性抑制剂可以促进TAU蛋白的逆转和恢复它的稳定。第一代HSP70抑制剂,如亚甲蓝(MB),能提高TAU蛋白病小鼠模型的学习和记忆能力。本研究探讨HSP70RNAi对AD的作用,采用遗传干预使HSP70RNAi在ninaE-GAIA/UAS系统的AD转基因果蝇模型视网膜光感受神经元中表达,观察HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型是否具有保护作用。

    1材料与方法

    1.1材料

    果蝇品系:w1118、ninaE-GAL4购自美国Bloomington果蝇中心;模型UAS-hTauR406W购自美国哈佛大学;双平衡系果蝇sco/CyO;TM3/TM6由中南大学医学遗传学国家重点实验室惠赠;HSP70RNAi由清华大学惠赠。

    1.2方法

    1.2.1果蝇杂交

    1.2.1.1构建w1118/+;ninaE-GALA/+的果蝇

    将w1118的处女蝇与ninaE-GAIA的雄性果蝇杂交,收取F1代,即基因型为wlll8/+;ninaE-GAIA/+的目的果蝇。即正常对照果蝇。

    1.2.1.2构建ninaE-GAIA/+;UAS-hTauR406W/+的果蝇将ninaE-GAIA处女蝇与UAS-hTauR406W雄性果蝇杂交即得到ninaE-GAIA/+;UAS-hTauR406W/+果蝇。

    1.2.1.3构建HSP70RNAi对AD转基因模型干预的果蝇将ninaE-GAIA处女蝇与sco/CyO;TM3/TM6雄性果蝇杂交,构建基因型为ninaE-GAL4/sco;+/TM3的果蝇;同时将UAS-hTauR406W处女蝇与sco/CyO;TM3/TM6雄性果蝇杂交,构建基因型为+/CyO;UAS-hTauR406W/TM6的果蝇;再将ninaE-GAIA/sco;+/TM3的处女蝇与+/CyO;UAS-hTauR406W/TM6雄性果蝇杂交,筛选卷翅且短刚毛的子代,即基因型为ninaE-GAIA/CyO;UAS-hTauR406W/TM3的目的果蝇。再将HSP70RNAi的处女蝇与ninaE-GAIA/CyO;UAS-hTauR406W/TM3的雄性果蝇杂交,筛选基因型为ninaE-GAIA/+;UAS-hTauR406W/HSP70RNAi的目的果蝇。即ninaE-GAIA/+;UAS-hTauR406W/HSP70RNAi的果蝇。

    1.2.2数据采集

    1.2.2.1观察果蝇复眼形态并拍照 用奥林巴斯体视显微镜观察第7天的雄性目的果蝇复眼结构。

    1.2.2.2应用试剂盒检测线粒体三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)浓度取第7天的w1118/+;ninaE-GAL4/+果蝇(正常对照组),ninaE-GAL4/+;UAS-hTauR406W/+果蝇(疾病模组),ninaE-GAL4/+;UAS-hTauR406W/HSP70RNAi果蝇(基因干预组)各10只雄性果蝇,切取果蝇头部;分别将果蝇加入0.1 LATP反应液中进行研磨,充分反应后调离心机转速为10 000 r/min离心15 min,分别取出0.01 L上清液加入96孔板后,再分别加入0.09 LATP反应液;将标准品按一定的浓度梯度稀释,并加入96孔板;室温避光反应15 min后,酶标仪测定OD值;减去本底发光值,制作标准曲线;根据标准曲线计算ATP浓度,计算ATP浓度与正常对照组的百分比。

    1.3统计学处理

    采用SPSS 18.0统计软件进行分析,用t检验。

    2结果

    2.1 AD转基因果蝇模型

    为鉴定AD转基因果蝇模型,本研究分别从果蝇表型、果蝇ATP分析比较正常对照组与AD转基因果蝇模型。结果显示。AD转基因果蝇模型复眼表面粗糙凹凸不平,面积较正常果蝇明显减小,色素沉着减少。详见图1。AD转基因果蝇模型与正常对照组相比较,其ATP明显降低,t=10.544 P<0.01。详见图2。

    2.2 HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型的影响

    为了探讨HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型是否有保护作用,本研究从果蝇表型、果蝇ATP分析HSP70RNAi对AD转基因果蝇模型的影响。结果显示HSP70RNAi对疾病模型干预后,果蝇复眼较疾病组呈现明显的好转,复眼表面光整,复眼面积稍增大,色素沉着加深。详见图3。ATP水平升高,t=-6.653,P<0.01。详见图4。, 百拇医药(顾凤鸣 李清华 刘开祥 郭丰宁 陈梅玲 曾爱源)
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