实验动物黑斑模型的建立及其研究
丁克祥，男，1958年生，第三军医大学海军医学院毕业，现任海军广州中心医院副院长、海军抗衰老研究中心主任，中山医科大学、第二军医大学硕士研究生导师，本刊编委，《中国老年学杂志》等8家学术期刊副主编、编委，发表学术论文一百多篇，专著7部参编2部，获军队科技进步奖18项(1等1项，2等6项，3等8项，4等3项)
摘 要 目的：为帮助临床和美容科研人员寻找祛斑药物和治疗的实验对象。方法：采用微量定点注射法将黑斑形成液注入动物皮下不同深度，并辅用紫外线照射法。结果：受试动物皮下可形成肉眼可见的黑斑，通过皮肤组织切片染色并用光镜和透射电镜观察，黑斑形成处皮肤组织细胞学结构与正常对照组有明显区别。结论：实验动物黑斑模型的建立，对推动美容医学色素性皮肤疾病的研究和治疗具有积极意义。
关键词 黑斑 模型 实验动物 皮肤
STUDY NO THE FOUNDATION OF BLACK SPOTS MODES
, 百拇医药
IN EXPERIMENTAL ANIMAL
Guangzhou Naval Central Hospital(Guangzhou,510318)
Ding Kexiang Chen Huadong Zhao Li et al
Abstract Objective:To look for a brug ang a therapy method of cleaning spots inlevel of preclinical medicine. Methods:Toadopt methods of micro-fixed-point injection and ultraviolet radiation,We inject formatixe liquid of biack spots into varying depth subcutaneous layer of animal. Results:Visible black spots come into being in subcutaneous layer of experimental animal.There is notable difference in skin histiocytic structure between tsst of skin becoming black spots and control group,by way of skin tissue slice staining and observatiopn with optical and transmission electron microscope.Conclusion: The black spots model in experimentalanimal may be founded under rigid experimental circumstances It will promote the study on pigmentary diseases in medical cosmetology.
, 百拇医药
Key wiords Black spots Model Experimental animl Skin
皮肤代谢性色素沉着系单纯性基底细胞层黑色素增多，是临床美容皮肤科常见的皮肤疾病。其种类和表现因其病因机制不同而不定，有些发病机制尚不清楚(1)。由于皮肤黑斑影响美容，严重时也影响皮肤的正常结构和功能，因此，人们希望在祛斑上寻找一些更加快速和有效的治疗药物和方法(2)。为了避免或减少新的祛斑药物和治疗方法对人体的损伤和副作用、探索药物最佳的剂量时间效应，同时也为了对皮肤色素沉着形成的病因机制作进一步深入研究，实验动物是非常必要的。我们采用幼年家猪作为实验动物并建立了实验动物黑斑模型，现将实验报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 幼年家猪，2头，年龄80天～90天，体重20kg～22kg,雌雄各半，由中山医科大学实验动物中心提供。经一周检疫后即投入实验。
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1.1.2 受试器材 全套特制微型注射器、精密游标卡尺、特制黑斑定位板及其它手术器械。
1.1.3 仪器设备 紫外线灯、切片机、蜡封机、显微镜、透射电镜及其配套设备等。
1.1.4 制剂 黑斑形成液、切片染色液、麻醉剂、生理盐水等。
1.2 实验方法
1.2.1 实验准备 先将动物用水冲洗干净，用3%戊巴比妥和4.3%水合三氯乙醛麻醉剂，按1ml/kg体重剂量进行腹腔注射。为了保证麻醉效果，本实验两种麻醉剂交叉使用。动物被麻醉后迅速抬上手术台固位、剪毛、再清洗和消毒。
1.2.2 实验方法 采用特制黑斑定位板固定在动物已备皮处，用碘酒-酒精消毒后，将已配制好的黑斑形成液充分混匀后抽入特制无菌微型注射器中，并按设计要求分别换上不同规格的特制针头，依次进行皮下注射，记录注射时间，并作好标记。以后每天1次用黑斑形成液轻轻点擦外部相应处并每天用紫外线灯照射，连续60天。对照组除用生理盐水代替黑斑形成液外，其它方法类同。实验期间，动物保持正常饲养的最适条件，并防止环境污染。
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1.2.3 切片染色及光镜、电镜检查法 分别取猪背部的对照皮肤和黑斑形成处皮肤进行切片、染色，并用光镜和电镜参照参考文献进行(3,4)观察。
2 结果
2.1 肉眼观察结果 黑斑形成液皮下注射的深浅对黑斑的形成有一定的影响。注射初期，注射部位可见黑斑形成液本身的颜色，且颜色因注射深浅略有差异。一周后，黑斑形成液的本色逐渐变淡，有些被皮下注射造成的创面痂皮掩盖，黑斑难辨。两周后创面痂皮脱落，暴露新生皮肤。30天后，浅表开始出现黑斑印迹，黑斑虽有些模糊不清，但已隐约可见，特别是皮下1.5mm～2.5mm处，黑斑形成较为清晰明显，形成类似雀斑形状和大小的黑斑斑点，随着时间的延长，至实验结束时斑点更加明显、清晰。
2.2 光镜和电镜观察 结果表明，经黑斑形成液皮下注射并在紫外线作用下所形成的黑斑皮肤表皮基底细胞层，其黑色素细胞产生的黑色素颗粒较正常对照组明显增多，光镜检查经Masson-Fontana黑色素染色的切片发现，表皮各层细胞内，特别是基底细胞层和棘细胞层内黑色素颗粒也较对照组明显增多，且这些表皮层细胞内黑色素颗粒也较正常皮肤增多；真皮浅层与表皮深层交接处的乳头状边接处也有程度不同的黑色素颗粒，与正常组对照比较，分布明显密集，散在范围也明显扩大。
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电镜检查，表皮角质层内的残存桥粒以及棘细胞和基底细胞内的线粒体、内质网的变性程度较正常对照组明显增多和加重，黑色素细胞结构完整，增生较正常对照组明显活跃，无桥粒及胞浆内无张力丝，胞体增大，突起增多，胞浆内可见到增加的黑色素及黑色素小体，黑素颗粒也较正常对照组明显增多。进一步观察还发现，黑斑形成处皮肤基层细胞层的黑色素细胞较正常对照组明显活跃，数目增加，多巴阳性反应持久，甚至发现个别较大的黑色素细胞和较多树状突起的黑色素细胞。
3 结论
3.1 动物黑斑模型是色斑，特别是雀斑治疗和研究的实验模型。虽然动物模型的黑斑与人体雀斑病因学和发生机制完全不同，出现的条件和影响因素也有很大差异，但动物模型所形成的黑斑与雀斑在外部形状、大小以及内部组织学结构及色素改变都比较相似。作者曾通过对动物模型黑斑的外部形态和内部结构与比较典型的雀斑进行对比，并通过病理切片、染色、镜检，也得出比较相似结论，因此，可以用此黑斑的动物模型进行雀斑的治疗和研究。
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本实验模型采用幼年家猪其皮肤的结构、功能、代谢特征、甚至血管分布、皮肤微循环等生理学和组织学指标均与人类皮肤极其相似(5)，但皮肤表皮基底细胞层中的黑素细胞的功能与人类略有差异，特别是人类雀斑的形成主要由显性遗传诱发色素代谢紊乱所致，并受内分泌、药物、季节、日光、心理等多种因素影响，而动物黑斑则完全依赖黑斑形成液和紫外光等外源性因素诱导产生，且动物所处的实验环境已基本不受雀斑形成因素的影响，因此尚不能完全将实验动物黑斑模型与雀斑等同看待。
3.2 关于动物皮肤黑斑形成的作用机制可能与黑斑形成液中的有关成分和紫外光辅助照射密切相关。黑斑形成液中含有制斑素、内皮素、黑素细胞和酪氨酸酶激活剂及其相关制剂等，这对剌激和促进黑素细胞的分裂、增殖以及多巴阳性反应活性，加快黑素颗粒的形成和色素沉积有一定的作用(6,8)，加上紫外光照射及被紫外光激活或促进的黑斑形成制剂的介导，使黑素细胞和黑素反应进一步加强，表皮基底细胞层黑色素进一步积累、沉着、黑斑形成更加明显(9,10)。
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本实验也证实黑斑形成与黑素细胞增殖，特别是黑素细胞功能和作为色素沉着决定因子的酪氨酸酶的活性和反应增强有关(11,12)。但黑斑形成液中相关成分如何促进黑素细胞增殖，提高黑素细胞功能以及这些成分的最佳比例对黑斑形成的时效量效关系，黑斑形成后的维持时间及其代谢变化规律尚有待于在今后的实验中进一步研究和完善。参考文献
1 倪容之.现代皮肤病治疗学，北京：人民军医出版社，1994：528～584
2 丁克祥.介绍24种抑制黑色素生成的中药，中国化妆品杂志，1994；6：123
3 邱丙森.皮肤组织病理学，上海科技出版社，1981：18～30
4 李海洋，赵文清，郑信民.自体全厚皮片表皮内黑素细胞的超微结构观察，滨州医学院学报，1995；18(5)：6
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5徐建国，尚靖.补骨脂对酪氨酸的激活作用，中草药，1991；22(4)：168
6 罗少华，李新荣.玉竹对酪氨酸酶的激活作用，中国生化药物杂志，1996；17(1)：25
7 李新兰，易业.DNA损伤将增加黑色素生成，国外医学，分子生物学分册，1996；18(6)：283
8 方家麟，李光中，孙慧珍等 经长期紫外线照射后豚鼠皮肤的组织形态，中华皮肤科杂志，1991；24(1)：11
9 胡继顺.紫外灯致黑色素沉着3例报告，中国工业医学杂志，1995；8(3)：170
10 李新荣.酪氨酸酶的酶活力学研究，南京铁道医学院学报，1992；11(1)：33
11 李涛，徐文严.作为色素沉着决定因子的酪氨酸酶在培养的人黑素细胞中的作用，国外医学，皮肤性病学分册，1994；20(3)：18
12 付小兵，王德文.创伤修复基础，北京：人民军医出版社，1997：186～187, http://www.100md.com(丁克祥 陈华东 赵莉 何晓宾 罗斌 黄冰 梁碧丽)
摘 要 目的：为帮助临床和美容科研人员寻找祛斑药物和治疗的实验对象。方法：采用微量定点注射法将黑斑形成液注入动物皮下不同深度，并辅用紫外线照射法。结果：受试动物皮下可形成肉眼可见的黑斑，通过皮肤组织切片染色并用光镜和透射电镜观察，黑斑形成处皮肤组织细胞学结构与正常对照组有明显区别。结论：实验动物黑斑模型的建立，对推动美容医学色素性皮肤疾病的研究和治疗具有积极意义。
关键词 黑斑 模型 实验动物 皮肤
STUDY NO THE FOUNDATION OF BLACK SPOTS MODES
, 百拇医药
IN EXPERIMENTAL ANIMAL
Guangzhou Naval Central Hospital(Guangzhou,510318)
Ding Kexiang Chen Huadong Zhao Li et al
Abstract Objective:To look for a brug ang a therapy method of cleaning spots inlevel of preclinical medicine. Methods:Toadopt methods of micro-fixed-point injection and ultraviolet radiation,We inject formatixe liquid of biack spots into varying depth subcutaneous layer of animal. Results:Visible black spots come into being in subcutaneous layer of experimental animal.There is notable difference in skin histiocytic structure between tsst of skin becoming black spots and control group,by way of skin tissue slice staining and observatiopn with optical and transmission electron microscope.Conclusion: The black spots model in experimentalanimal may be founded under rigid experimental circumstances It will promote the study on pigmentary diseases in medical cosmetology.
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Key wiords Black spots Model Experimental animl Skin
皮肤代谢性色素沉着系单纯性基底细胞层黑色素增多，是临床美容皮肤科常见的皮肤疾病。其种类和表现因其病因机制不同而不定，有些发病机制尚不清楚(1)。由于皮肤黑斑影响美容，严重时也影响皮肤的正常结构和功能，因此，人们希望在祛斑上寻找一些更加快速和有效的治疗药物和方法(2)。为了避免或减少新的祛斑药物和治疗方法对人体的损伤和副作用、探索药物最佳的剂量时间效应，同时也为了对皮肤色素沉着形成的病因机制作进一步深入研究，实验动物是非常必要的。我们采用幼年家猪作为实验动物并建立了实验动物黑斑模型，现将实验报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 幼年家猪，2头，年龄80天～90天，体重20kg～22kg,雌雄各半，由中山医科大学实验动物中心提供。经一周检疫后即投入实验。
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1.1.2 受试器材 全套特制微型注射器、精密游标卡尺、特制黑斑定位板及其它手术器械。
1.1.3 仪器设备 紫外线灯、切片机、蜡封机、显微镜、透射电镜及其配套设备等。
1.1.4 制剂 黑斑形成液、切片染色液、麻醉剂、生理盐水等。
1.2 实验方法
1.2.1 实验准备 先将动物用水冲洗干净，用3%戊巴比妥和4.3%水合三氯乙醛麻醉剂，按1ml/kg体重剂量进行腹腔注射。为了保证麻醉效果，本实验两种麻醉剂交叉使用。动物被麻醉后迅速抬上手术台固位、剪毛、再清洗和消毒。
1.2.2 实验方法 采用特制黑斑定位板固定在动物已备皮处，用碘酒-酒精消毒后，将已配制好的黑斑形成液充分混匀后抽入特制无菌微型注射器中，并按设计要求分别换上不同规格的特制针头，依次进行皮下注射，记录注射时间，并作好标记。以后每天1次用黑斑形成液轻轻点擦外部相应处并每天用紫外线灯照射，连续60天。对照组除用生理盐水代替黑斑形成液外，其它方法类同。实验期间，动物保持正常饲养的最适条件，并防止环境污染。
, 百拇医药
1.2.3 切片染色及光镜、电镜检查法 分别取猪背部的对照皮肤和黑斑形成处皮肤进行切片、染色，并用光镜和电镜参照参考文献进行(3,4)观察。
2 结果
2.1 肉眼观察结果 黑斑形成液皮下注射的深浅对黑斑的形成有一定的影响。注射初期，注射部位可见黑斑形成液本身的颜色，且颜色因注射深浅略有差异。一周后，黑斑形成液的本色逐渐变淡，有些被皮下注射造成的创面痂皮掩盖，黑斑难辨。两周后创面痂皮脱落，暴露新生皮肤。30天后，浅表开始出现黑斑印迹，黑斑虽有些模糊不清，但已隐约可见，特别是皮下1.5mm～2.5mm处，黑斑形成较为清晰明显，形成类似雀斑形状和大小的黑斑斑点，随着时间的延长，至实验结束时斑点更加明显、清晰。
2.2 光镜和电镜观察 结果表明，经黑斑形成液皮下注射并在紫外线作用下所形成的黑斑皮肤表皮基底细胞层，其黑色素细胞产生的黑色素颗粒较正常对照组明显增多，光镜检查经Masson-Fontana黑色素染色的切片发现，表皮各层细胞内，特别是基底细胞层和棘细胞层内黑色素颗粒也较对照组明显增多，且这些表皮层细胞内黑色素颗粒也较正常皮肤增多；真皮浅层与表皮深层交接处的乳头状边接处也有程度不同的黑色素颗粒，与正常组对照比较，分布明显密集，散在范围也明显扩大。
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电镜检查，表皮角质层内的残存桥粒以及棘细胞和基底细胞内的线粒体、内质网的变性程度较正常对照组明显增多和加重，黑色素细胞结构完整，增生较正常对照组明显活跃，无桥粒及胞浆内无张力丝，胞体增大，突起增多，胞浆内可见到增加的黑色素及黑色素小体，黑素颗粒也较正常对照组明显增多。进一步观察还发现，黑斑形成处皮肤基层细胞层的黑色素细胞较正常对照组明显活跃，数目增加，多巴阳性反应持久，甚至发现个别较大的黑色素细胞和较多树状突起的黑色素细胞。
3 结论
3.1 动物黑斑模型是色斑，特别是雀斑治疗和研究的实验模型。虽然动物模型的黑斑与人体雀斑病因学和发生机制完全不同，出现的条件和影响因素也有很大差异，但动物模型所形成的黑斑与雀斑在外部形状、大小以及内部组织学结构及色素改变都比较相似。作者曾通过对动物模型黑斑的外部形态和内部结构与比较典型的雀斑进行对比，并通过病理切片、染色、镜检，也得出比较相似结论，因此，可以用此黑斑的动物模型进行雀斑的治疗和研究。
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本实验模型采用幼年家猪其皮肤的结构、功能、代谢特征、甚至血管分布、皮肤微循环等生理学和组织学指标均与人类皮肤极其相似(5)，但皮肤表皮基底细胞层中的黑素细胞的功能与人类略有差异，特别是人类雀斑的形成主要由显性遗传诱发色素代谢紊乱所致，并受内分泌、药物、季节、日光、心理等多种因素影响，而动物黑斑则完全依赖黑斑形成液和紫外光等外源性因素诱导产生，且动物所处的实验环境已基本不受雀斑形成因素的影响，因此尚不能完全将实验动物黑斑模型与雀斑等同看待。
3.2 关于动物皮肤黑斑形成的作用机制可能与黑斑形成液中的有关成分和紫外光辅助照射密切相关。黑斑形成液中含有制斑素、内皮素、黑素细胞和酪氨酸酶激活剂及其相关制剂等，这对剌激和促进黑素细胞的分裂、增殖以及多巴阳性反应活性，加快黑素颗粒的形成和色素沉积有一定的作用(6,8)，加上紫外光照射及被紫外光激活或促进的黑斑形成制剂的介导，使黑素细胞和黑素反应进一步加强，表皮基底细胞层黑色素进一步积累、沉着、黑斑形成更加明显(9,10)。
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本实验也证实黑斑形成与黑素细胞增殖，特别是黑素细胞功能和作为色素沉着决定因子的酪氨酸酶的活性和反应增强有关(11,12)。但黑斑形成液中相关成分如何促进黑素细胞增殖，提高黑素细胞功能以及这些成分的最佳比例对黑斑形成的时效量效关系，黑斑形成后的维持时间及其代谢变化规律尚有待于在今后的实验中进一步研究和完善。参考文献
1 倪容之.现代皮肤病治疗学，北京：人民军医出版社，1994：528～584
2 丁克祥.介绍24种抑制黑色素生成的中药，中国化妆品杂志，1994；6：123
3 邱丙森.皮肤组织病理学，上海科技出版社，1981：18～30
4 李海洋，赵文清，郑信民.自体全厚皮片表皮内黑素细胞的超微结构观察，滨州医学院学报，1995；18(5)：6
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5徐建国，尚靖.补骨脂对酪氨酸的激活作用，中草药，1991；22(4)：168
6 罗少华，李新荣.玉竹对酪氨酸酶的激活作用，中国生化药物杂志，1996；17(1)：25
7 李新兰，易业.DNA损伤将增加黑色素生成，国外医学，分子生物学分册，1996；18(6)：283
8 方家麟，李光中，孙慧珍等 经长期紫外线照射后豚鼠皮肤的组织形态，中华皮肤科杂志，1991；24(1)：11
9 胡继顺.紫外灯致黑色素沉着3例报告，中国工业医学杂志，1995；8(3)：170
10 李新荣.酪氨酸酶的酶活力学研究，南京铁道医学院学报，1992；11(1)：33
11 李涛，徐文严.作为色素沉着决定因子的酪氨酸酶在培养的人黑素细胞中的作用，国外医学，皮肤性病学分册，1994；20(3)：18
12 付小兵，王德文.创伤修复基础，北京：人民军医出版社，1997：186～187, http://www.100md.com(丁克祥 陈华东 赵莉 何晓宾 罗斌 黄冰 梁碧丽)