三羟基异黄酮诱导增生性瘢痕成纤维细胞凋亡及其机制研究(1)
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[摘要]目的：探讨三羟基异黄酮(Geni stein)诱导体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的作用及相关机制。方法：体外分离培养人增生性瘢痕成纤维细胞，不同浓度Geni stein作用后，MTT比色法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况，We stern Blot法检测细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达。结果：在6eni stein作用下，增生性瘢痕成纤维细胞的生长受到抑制；细胞凋亡率增加，与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)；Bcl-2的表达下调、Bax、Caspase-3表达增加。结论：Geni stein可通过诱导凋亡抑制增生性瘢痕成纤维细胞增殖，其作用机制可能与影响Bcl-2、Bax、Caspa se-3等凋亡调控基因的表达有关。
[关键词]三羟基异黄酮；增生性瘢痕：凋亡；Bcl-2；Bax；Caspase-3
[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]l008-6455(2007)05-0600-03
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对增生性瘢痕(hyperplastic scar，Hs)防治的研究仍是医学界的难题，目前尚未找到理想的治疗约物。研究表明，成纤维细胞的增殖与凋亡之间的失衡与病理性瘢痕的形成具有密切关系，通过对成纤维细胞凋亡的诱导可有效抑制瘢痕增生从而达到治疗瘢痕的作用。5，7，4’一三羟基异黄酮(Genistein)是来源可豆类的植物雌激素类化合物，研究表明其对多种恶性肿瘤细胞具有诱导凋亡、抑制生长的作用，对组织器官纤维化也有一定的治疗效果。本实验研究Genistein对体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的作用并探讨其可能机制，为临床应用Genistein治疗病理性瘢痕提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 主要仪器：YJ-875型超净上作台(苏州净化设备公司)、1815TC型二氧化碳培养箱(美国SHEL-LAB)、550型酶标仪(美国BIO-RAD)、FACS Caliber流式细胞仪(美国Bencton Dickinson)、Mini-PROTEAN型电泳槽(美国Bio-Rad)、Gel Doc2000型凝胶成像系统(美国Bio-Rad)。
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1.2 主要试剂：5，7，4’一三羟基异黄酮(Sigma，美国)、DMEM细胞培养基(Hyclone，美国)、四甲基偶氮唑蓝(rrT)(Sigma，美国)、碘化丙啶(PI)(sigma，美国)、小鼠人Bcl-2单克隆抗体(Santa Cruz，美国)、小鼠抗人Bax单克隆抗体(Santa Cruz，美国)、小鼠抗人Caspase-3单克隆抗体(santaCruz，美国)、Western blotting检测试剂盒(武汉博士德公司)。
1.3 细胞培养和分组处理：采用组织块法行瘢痕成纤维细胞原代培养(增生性瘢痕组织来源于本院6例深II度烧伤后5～8月瘢痕患者手术所取标本，瘢痕外观充血发红、质硬，高于皮面1cm以上，处于增生活跃期；局部无感染和溃疡；未使用过激素类药物、抗肿瘤药物以及未曾接受放射治疗者)，培养体系为DMEM培养液(含体积分数10%的新生小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)。将瘢痕切成1mm3大小组织块置于培养瓶中，在5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养6～8h，待组织块贴壁后加入DMEM培养基继续培养；原代细胞生长成单层后，每4～5天分种传代1次，实验用第3～5代细胞。将处于对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液接种于96孔平面培养板中，调整细胞数为2.5×104/ml，每孔细胞悬液200ul。实验组分别加入DMSO配制终浓度为25umol/L、50umol/L、100umol/L的Geni stein；对照组只加同体积的DMSO；各组设3个复孔，继续培养48h。
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1.4 MTT法检测细胞增殖：分别于每孔加入0.5%MTT溶液20ul，37℃继续培养4h，小心吸弃上清，每孔加入150ul DMSO震荡15min，振荡待紫蓝色结晶完全溶解，以酶标仪在490nm波长检测各孔的光密度值(OD值)。
1.5 流式细胞分析测定细胞凋亡：用PBS冲洗细胞，0.25%胰蛋白酶消化分离细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，70%冷乙醇固定，PBS离心洗涤三次，加入lml PBS及RNA酶A5ul，37℃作用30min，加入碘化丙啶(PI)在4℃染色30min，进行流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。
1.6 Western Blot蛋白免疫印迹法测定细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达：常规收集各组细胞，加入预冷的NP-40细胞裂解液冰上静置30min裂解细胞，4℃振荡离心，收集上清，Lowry法测定蛋白含量。加适量上样缓冲液100℃热变性5min，取100ug总蛋白在10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳；再将凝胶中的蛋白质低温电转移至硝酸纤维素膜；按Western blotting试剂盒操作步骤分别加入一抗及FITC-TgG二抗讲行反应(内参照为β-actin蛋白)，用荧光成像分析系统采集蛋白电泳条带，Quangtity One软件分析计算得到蛋白表达指数EI。EI＝(目的蛋白条带面积×灰度)/(内参照蛋白条带面积×灰度)
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1.7 统计学处理：采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，实验数据以x±s表示，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著。
2 结果
2.1细胞增殖：各组Genistein处理后细胞的增殖均受到抑制，与对照组相比有显著性差异(P
2.3 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达：样品蛋白经电泳后得到相应大小片段的产物，在显像系统下可见相应表达带(图1)，经内参标准化后得到各组蛋白表达指数(表3)。结果显示在Genistein作用下，Bcl-2蛋向的表达随6enistein浓度增加而减弱，而Bax及Caspase-3的表达逐渐增强，与对照相比差异具有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
细胞凋亡(apoptosis)是一种多基因调控的程序性死亡过程，它是调控机体生长发育、维护内环境平衡的一种重要的自我调节机制。病理性瘢痕的发生与瘢痕成纤维细胞的异常增殖与凋亡不足有密切关系，促进细胞凋亡是治疗增生性瘢痕的有效手段。
细胞凋亡受多种凋亡相关基因编码的蛋白调
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